蘇學(xué)思，張玉寶，王若愚，王亞軍，唐國亮，金衛(wèi)杰

(1.中國科學(xué)院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院皋蘭生態(tài)與農(nóng)業(yè)綜合試驗站，甘肅 蘭州730000； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

車前草花葉病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus，PlAMV)由Minskaya等[1]于1977年在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的車前草上首次發(fā)現(xiàn)，后來被證實是侵染百合的重要病毒之一。PlAMV屬于甲型線狀病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)成員，在透射電子顯微鏡下可觀察到絲狀的病毒顆粒，其大小約為(490～530)nm × (11～13)nm[2]。該病毒基因組由一條正義單鏈RNA組成，長度約為6 100 nt，共編碼5個開放閱讀框(open reading frame，ORF)[3]。ORF1編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，主要負(fù)責(zé)病毒核酸的復(fù)制[4]。ORF2、ORF3和ORF4分別編碼230、110、121個氨基酸，組成了三基因連鎖結(jié)構(gòu)(triple gene block proteins，TGBp)，能夠幫助病毒在植物細(xì)胞間移動，并抑制植物的基因沉默作用[5-6]。ORF5由624個核糖核苷酸組成，編碼病毒的衣殼蛋白(capsid protein，CP)，該蛋白由207個氨基酸構(gòu)成，是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，和病毒的移動與侵染有關(guān)[7]。

2010年荷蘭首次報道了PlAMV對百合生長的危害，隨后該病毒在美國、日本、意大利和智利等國家的百合上被相繼檢出[8-13]。PlAMV能通過土壤和機(jī)械傳播，被侵染的雜草也具有傳播該病毒的可能[14]。PlAMV的土壤傳播可能與植物根的吸收或滲出有關(guān)，但不清楚是否存在傳播媒介[8]。此外，PlAMV寄主廣泛，能侵染16科的植物，其中，百合、報春花、南天竹、地黃、櫻草、紫花堇菜等皆為重要的中藥材或花卉作物[9]。受PlAMV侵染的百合，初期癥狀主要表現(xiàn)為花葉、銹斑、葉片褪綠等，后期表現(xiàn)為嚴(yán)重壞死、生長緩慢、植株矮化等(圖1)[14-16]。在荷蘭對PlAMV的報道中，該病毒對溫室生長的百合具有更加嚴(yán)重的危害，造成切花出現(xiàn)碎色、條紋癥狀，產(chǎn)量損失達(dá)80%[15]。

田間病毒診斷和監(jiān)測是百合PlAMV的主要防治措施，為控制病毒危害，迫切需要開發(fā)快速、特異、靈敏、高效的病毒檢測技術(shù)。目前國內(nèi)外檢測PlAMV多采用RT-PCR方法[16-17]，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高；但是復(fù)雜的操作、對技術(shù)人員的高要求，以及對昂貴儀器設(shè)備的依賴限制了該方法的推廣應(yīng)用。與之相比，ELISA、膠體金免疫層析等血清學(xué)檢測方法不僅具備高特異性和高靈敏性的特點，而且操作簡單，具備快速檢測大批量樣品的能力，更適于田間百合病毒的調(diào)查和監(jiān)測[18-19]。通過構(gòu)建目的基因原核表達(dá)載體的方法制備抗原，能克服直接純化病毒顆粒的困難，顯著提高抗原的純度和濃度，利用這種方法制備的抗體具備更好的特異性和效價。據(jù)此，本研究以感染PlAMV的百合為材料，克隆PlAMVcp基因的部分序列，進(jìn)行序列分析。通過構(gòu)建PlAMVcp基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了大量純化的PlAMV CP融合蛋白，并以此為抗原制備特異性良好的多克隆抗體，以期為PlAMV的血清學(xué)檢測技術(shù)開發(fā)和致病機(jī)理研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

感染百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、百合斑駁病毒(Lilymottlevirus，LMoV)和PlAMV的百合樣品，以及感染馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)的馬鈴薯樣品均由本實驗室保存。

圖1 感染Plantago asiatica mosaic virus的百合Fig.1 Lily infected with Plantago asiatica mosaic virus exhibiting symptoms of rust-brown necrotic strips and spots

植物總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit)購自天根生化科技(北京)有限公司；植物蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；質(zhì)粒微量抽提試劑盒(E.Z.N.A.?Plasmid DNA Mini Kit Ⅰ)購自O(shè)mega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)、DNA回收試劑盒(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit)和克隆載體pMDTM19-T購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-NTA預(yù)裝重力柱(Ni-NTA Pre-Packed Gravity Column)和NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑盒(藍(lán)色)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)菌株和表達(dá)載體pET-28a(+)由本實驗室保存。

1.2 引物設(shè)計與PlAMV cp序列的克隆

根據(jù)NCBI公布的百合PlAMVcp基因序列(GenBank登錄號：KX245539)，采用Primer Premier 5軟件和Oligo 7軟件設(shè)計如下特異性引物(下劃線表示引入的酶切位點BamH Ⅰ和SalⅠ)：F:5′-GCGGATCCATGGCACTCAACCAAGCC-3′；R:5′-CTTGTCGACATCGGAGGGGGAGGGGA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成PlAMV第1鏈cDNA，再以第1鏈cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增PlAMVcp基因。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)擴(kuò)增30次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過DNA回收試劑盒回收目的片段；純化片段連接T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切驗證后，陽性質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，測序證實序列正確后命名為pMD19-T-PlAMV，并借助BLAST、ClustalW和DNAStar軟件進(jìn)行序列比對、分析，以及PlAMV CP蛋白的抗原表位預(yù)測。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切pMD19-T-PlAMV質(zhì)粒和pET-28a(+)質(zhì)粒，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后通過DNA回收試劑盒純化目的片段，16 ℃連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，然后挑選單克隆進(jìn)行PCR驗證。陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切、1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將陽性質(zhì)粒命名為pET-28a-PlAMV。未經(jīng)酶切處理的pET-28a-PlAMV質(zhì)粒作為雙酶切鑒定陽性克隆的對照。

1.4 PlAMV CP蛋白的原核表達(dá)

取pET-28a-PlAMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株，挑取單克隆接入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第2天按照體積比1∶100接種于同樣的培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)。當(dāng)D600為0.7時，分別加入0、0.5、1.0、1.5 和2.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)4 h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳。相同條件誘導(dǎo)未插入目的基因的E.coliBL21(DE3)菌株表達(dá)蛋白作為陰性對照。

為獲得純化的PlAMV CP蛋白，按照同樣的實驗條件，誘導(dǎo)培養(yǎng)1 L菌體。收集菌體后，首先用0.01 mol·L-1PBS溶液懸浮菌體，然后使用超聲機(jī)破碎至菌液澄清透亮，接著離心后取上清，最后按照Ni-NTA重力柱操作指南純化目的蛋白。

1.5 PlAMV CP多克隆抗體的制備

用純化的PlAMV CP蛋白(1 mg·mL-1)作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。具體免疫情況如下：將1 mg純化蛋白和完全弗氏佐劑(初次免疫)或不完全弗氏佐劑(增強(qiáng)免疫)等量混合均勻，進(jìn)行皮下多點注射。共進(jìn)行4次免疫，每次免疫間隔21 d，第4次免疫2周后取全血，分離得到抗血清。間接ELISA測定效價，Protein A親和層析柱純化兔抗血清，從而獲得兔抗PlAMV多克隆抗體IgG。

1.6 PlAMV CP多克隆抗體的鑒定

稱取0.1～0.2 g健康和分別感染LSV、CMV、LMoV和PlAMV的百合葉片，以及感染PVX的馬鈴薯葉片，加入液氮研磨，按照植物蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白。蛋白樣品經(jīng)煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白于15 V恒壓下轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后移入5%脫脂奶粉配制的封閉液中4 ℃封閉。以制備的PlAMV CP多克隆抗體作為一抗(1∶1 000)，AP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗(1∶10 000)，通過NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑盒(藍(lán)色)顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PlAMV cp序列的克隆

以侵染東方百合雜交品種Robina的PlAMV基因組RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增PlAMVcp基因的部分序列。電泳檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段的大小為500～750 bp，與預(yù)期的PlAMVcp基因大小一致(621 bp)(圖2)。

2.2 測序結(jié)果與序列分析

對陽性pMD-19T重組質(zhì)粒分別從兩端進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒序列與已知百合PlAMVcp基因序列(KX245539)的相似性達(dá)到100%。將該序列與GenBank中已注冊的PlAMVcp基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各分離物之間核苷酸序列的相似性為74.7%～100%，氨基酸序列的相似性為83.6%～100%。其中，甘肅皋蘭分離物(克隆所得序列)與百合PlAMV分離物親緣關(guān)系更近，核苷酸序列相似性為85.7%～100%，氨基酸序列相似性為92.8%～100%；與紫花堇菜(LC155796)、南天竹(LC155795)、車前草(KU697313)、地黃(KY923700)和報春花(AB360796)等其他植物PlAMV分離物的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，核苷酸序列相似性為74.7%～86.4%，氨基酸序列相似性為83.6%～93.7%。

從NCBI中選取不同植物PlAMV分離物的cp序列，以鄰接法(N-J法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，分析甘肅皋蘭分離物與其他植物分離物之間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，不同PlAMV分離物可明顯分為2個大組。第1大組內(nèi)，百合的PlAMVcp序列可聚為一個分支，煙草、車前草、地黃的PlAMVcp序列可聚為另一個分支；而紫花堇菜的PlAMVcp序列，相比其他分離物，單獨被分為一個大組；表明PlAMV的種群分布表現(xiàn)出寄主之間的差異性。在百合分離物聚成的分支內(nèi)部，甘肅皋蘭分離物與中國(KX245539)、韓國(KU159091)、荷蘭(KU870359)、意大利(LN651194)和英國(MK005151)的百合分離物具有較近的親緣關(guān)系，而與日本百合分離物(AB360790-AB360795)的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。表明PlAMV的種群分布可能存在區(qū)域差異。

M，DNA 2 000 marker；1，陰性對照；2，PlAMV cp基因。M， DNA 2 000 marker; 1， Negative control; 2， PlAMV cp gene.圖2 PlAMV cp基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification result of PlAMV cp gene

2.3 PlAMV CP蛋白的抗原表位預(yù)測

從NCBI上選取具有完整PlAMVcp序列的分離物進(jìn)行ClustalW多序列比對，獲得相似性達(dá)到90%的保守氨基酸位點。通過DNAStar 7.1軟件分析甘肅皋蘭分離物PlAMV CP蛋白的二級結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，預(yù)測其抗原表位(圖4)。選擇抗原性指數(shù)較高(指數(shù)≥0)、親水性好(指數(shù)≥0)、柔韌性好(指數(shù)≥0)且具有β轉(zhuǎn)角或無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的區(qū)域作為抗原表位(氨基酸數(shù)量≥4)。預(yù)測結(jié)果表明，抗原表位由35個氨基酸組成，其中28個是保守氨基酸，表明PlAMV CP蛋白的抗原表位保守。

2.4 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增pET-28a重組質(zhì)粒，得到約600 bp的目的片段，與預(yù)期的PlAMVcp序列大小一致(621 bp)。重組原核表達(dá)載體經(jīng)BamH Ⅰ和SalⅠ切割后出現(xiàn)2個條帶，獲得了預(yù)期大小的目的片段(621 bp)，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖5)。

2.5 PlAMV CP蛋白的表達(dá)與純化

取pET-28a-PlAMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在IPTG誘導(dǎo)下，預(yù)期大小的位置處均有明顯的蛋白表達(dá)(圖6-A)。但是隨著IPTG濃度從0.5 mmol·L-1逐漸增加到2.0 mmol·L-1，目的蛋白表達(dá)量沒有顯著變化。擴(kuò)大培養(yǎng)1 L菌體，經(jīng)Ni-NTA重力柱純化獲得PlAMV CP蛋白，無非特異性條帶產(chǎn)生(圖6-B)。

2.6 ELISA測定抗血清效價

圖3 基于PlAMV cp基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PlAMV isolates based on the nucleotide sequences of their cp genes

圖4 PlAMV CP蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性和抗原性預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure， hydrophilicity， flexibility and antigenicity of PlAMV CP protein

為制備抗PlAMV CP蛋白的多克隆抗體，將純化的CP蛋白免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，通過間接ELISA測定抗血清效價。結(jié)果顯示，制備的抗血清效價可達(dá)到32 000(表1)，表明純化的CP蛋白具有較好的免疫原性，制備的多克隆抗體具備高效價。

2.7 Western blot免疫印跡

提取百合和馬鈴薯葉片總蛋白，經(jīng)Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)抗體與感染PlAMV的百合樣品在預(yù)期大小位置處發(fā)生特異性反應(yīng)，而與健康百合樣品、分別感染LSV、CMV和LMoV的百合樣品，以及感染PVX的馬鈴薯樣品無交叉反應(yīng)，表明抗體能夠特異性結(jié)合PlAMV CP蛋白，具有良好的特異性(圖7)。

M，DNA Marker；1，未經(jīng)酶切的pET-28a重組質(zhì)粒；2～3，pET-28a重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果。M， DNA Marker; 1， Recombinant plasmid pET-28a without enzyme digestion; 2-3， Double enzyme digestion of recombinant plasmid pET-28a.圖5 pET-28a重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of recombinant plasmid pET-28a by double enzyme digestion

3 結(jié)論與討論

全球化貿(mào)易推動了世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，但是也為病毒的傳播搭建了橋梁，PlAMV目前已發(fā)展成一種世界性的作物病毒。建立具有良好穩(wěn)定性、特異性、靈敏性的病毒檢測技術(shù)體系，對于PlAMV的檢測、診斷、預(yù)警和防控具有重要意義。依賴RNA提取的核酸檢測技術(shù)，需要專門的技術(shù)人員，不易普及。而血清學(xué)檢測技術(shù)操作簡便，同時能夠快速檢測大批量樣品，適于田間大規(guī)模應(yīng)用。為獲得優(yōu)質(zhì)抗原，選擇構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得目的蛋白，相較于傳統(tǒng)的純化病毒顆粒制備抗原的方法，擺脫了對超高速離心機(jī)等儀器的依賴，降低了難度，從而大大提升血清學(xué)檢測技術(shù)開發(fā)的速度以及檢測的靈敏性和特異性[20]。

A，PlAMV CP蛋白的原核表達(dá)：M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為pET-28a空載體對照；2～6 分別為0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的PlAMV CP蛋白。B，PlAMV CP蛋白的純化：M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2為純化的重組CP蛋白。A， Prokaryotic expression of recombinant PlAMV CP: M， Protein marker; 1， Negative control of pET-28a without cp gene inserted; 2-6， Expression of PlAMV CP induced by 0， 0.5， 1.0， 1.5 and 2.0 mmol·L-1 IPTG， respectively. B， Purification of recombinant PlAMV CP: M， Protein marker; 1-2， Purified recombinant PlAMV CP protein.圖6 PlAMV CP重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant PlAMV CP

表1 ELISA測定CP抗血清效價

續(xù)表1 Continued Table 1

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，健康百合樣品；2～4，分別感染LSV、CMV和LMoV的百合樣品；5，感染PVX的馬鈴薯樣品；6，感染PlAMV的百合樣品。M， Protein marker; 1， Negative control of healthy lily; 2-4， Extracts from lily samples infected with LSV， CMV and LMoV， respectively; 5， Extracts from potato samples infected with PVX; 6， Extracts from lily samples infected with PlAMV.圖7 Western blot鑒定PlAMV CP多克隆抗體Fig.7 Western blot analysis of PlAMV CP using rabbit polyclonal antibody

病毒CP蛋白具有較好的免疫原性，通常被作為制備抗體的抗原[21-22]，這和借助DNAStar軟件預(yù)測得到PlAMV CP蛋白的抗原表位保守的結(jié)果一致。因此，本研究構(gòu)建PlAMVcp基因的原核表達(dá)載體，并以純化PlAMV CP蛋白為抗原制備了多克隆抗體，這些工作對于血清學(xué)檢測技術(shù)開發(fā)，以及進(jìn)一步的病毒蛋白功能研究都具有積極意義。

植物RNA病毒群體變異速度快且方式多樣，這是病毒適應(yīng)寄主環(huán)境的主要方式，也是病毒進(jìn)化的主要動力[23]。本研究通過構(gòu)建cp序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，以分析不同PlAMV分離物之間的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PlAMV種群分布可能存在寄主差異和區(qū)域差異。甘肅分離物與其他百合分離物的核苷酸相似性最高達(dá)到100%，而與紫花堇菜分離物的相似性不到75%；此外，百合PlAMV分離物中日本與其他區(qū)域分離物序列差異最大。這些事實暗示了PlAMV種群分布可能存在寄主差異和區(qū)域差異。若要進(jìn)一步探究種群基因組的遺傳多樣性、自然重組事件和進(jìn)化選擇壓力，還需要更多來自不同地域、不同宿主的分離物的信息支持[24]。

原核表達(dá)病毒CP蛋白，省時省力，被廣泛應(yīng)用于植物病毒抗體制備。為提高CP蛋白的表達(dá)量，獲得特異性良好和效價高的抗體，初步探究了重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件。設(shè)置了CP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的IPTG濃度，探究IPTG濃度對CP蛋白表達(dá)量的影響。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入IPTG誘導(dǎo)，PlAMV CP蛋白表達(dá)量得到明顯提高，但是不同濃度IPTG作用下CP蛋白的表達(dá)量沒有顯著差異。這個結(jié)論與前人的研究結(jié)果基本一致，可能由于IPTG濃度過高，對E.coliBL21(DE3)菌株生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用，從而使不同濃度誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá)未出現(xiàn)明顯差異[25]。

CP蛋白作為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其表達(dá)和分布對病毒的侵染和復(fù)制都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7，26]。然而目前的研究中還未發(fā)現(xiàn)與PlAMV CP蛋白互作的寄主因子。因此，需要檢測PlAMV病毒侵染過程中CP蛋白表達(dá)量的變化，并結(jié)合植物轉(zhuǎn)錄組測序，預(yù)測出與CP蛋白互作的潛在的寄主因子。本研究采用 Western blot分析百合葉片中病毒蛋白表達(dá)。制備的抗體與健康百合樣品和分別感染LSV、CMV、LMoV的百合樣品，以及感染PVX馬鈴薯樣品的總蛋白無特異性結(jié)合，而與感染PlAMV百合樣品的總蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，這表明本研究所制備的抗體能特異結(jié)合天然病毒蛋白，可用于檢測植物材料中PlAMV的蛋白表達(dá)。