徐雪芬，倪春輝，李惠霞，*，李煥宇，李文豪，陳 垣，胡芳弟

(1.甘肅農業(yè)大學 植物保護學院 甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農業(yè)大學 農學院，甘肅 蘭州 730070； 3.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730030)

黨參為桔?？浦参稂h參(Codonopsispilosula)、素花黨參(Codonopsispilosula)和川黨參(Codonopisistangshen)的干燥根，性味甘、平，歸脾，肺經，有健脾益肺，養(yǎng)血生津之功效，為我國傳統(tǒng)的補益藥，也是藥食同源植物[1]，可作為人參入藥，是中國最早規(guī)模種植和外銷出口創(chuàng)匯的著名優(yōu)質藥材?，F代研究表明，黨參中含有多糖、酚類、炔苷、三萜類與多種人體必需氨基酸等，具有增強免疫、補中益氣、養(yǎng)血生津、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[2]。甘肅省是主產黨參的省份之一，目前，黨參年種植面積約26.68萬hm2，產量約4萬t，占全國總產量的70%，出口量占全國總量的80%。其中，甘肅省渭源縣被譽為“中國黨參之鄉(xiāng)”，主要生產白條黨參，種植面積約6.70 萬hm2，約占全省種植面積的四分之一[3]。

近年來，隨著市場需求增大，價格持續(xù)上漲，黨參種植面積不斷擴大。但由于長期連作、農藥化肥過量使用、生長環(huán)境的改變和病原菌不斷積累，黨參病害已成為制約甘肅省黨參產量和品質提高的重要因素之一，對黨參安全生產構成威脅[4]。目前已經報道的黨參病害有黨參銹病、紫紋羽病、白粉病、斑枯病、灰霉病、黑斑病與根腐病。其中，黨參根腐病發(fā)生最為普遍且危害較重，嚴重危害根莖，致使黨參產量與品質嚴重下降。根腐病病原較為復雜，大多為幾種病原復合侵染。目前文獻中已報道的黨參根腐病的病原主要有鐮孢菌屬(Fusarium)和柱孢屬(ylindrocapon)，趙純森等[5]發(fā)現，黨參根腐病原菌為尖鐮孢菌(F.oxysporum)和柱孢屬(Cylindrocaponsp.)。王艷等[3]、余中蓮等[6]分別將甘肅黨參主產區(qū)與重慶市的黨參根腐病病原鑒定為尖鐮孢菌(F.oxysporum)。孫新榮等[7]根據癥狀將渭源縣黨參根腐發(fā)病植株分為急性青枯型和慢性黃腐型，病原菌分別為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)。此外，藥農由于缺乏對該病的了解，盲目用藥，導致黨參質量受到嚴重影響。因此，本研究擬通過病原菌的分離純化、致病性測定、形態(tài)學鑒定、分子生物學鑒定和病原菌的殺菌劑毒力作進一步探索性研究，以明確渭源縣黨參根腐病原菌的物種組成和有效殺菌劑，以期為甘肅省渭源縣黨參根腐病病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試黨參

黨參病樣采自甘肅省渭源縣，置于保鮮盒，帶回實驗室進行分離純化與后續(xù)試驗。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

WA培養(yǎng)基(瓊脂20 g、水1 L)；

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 L)；

CLA培養(yǎng)基(康乃馨葉片3 mm×3 mm約10 片左右、瓊脂20 g、水1 L)。

1.1.3 供試藥劑

供試藥劑如表1所示。

1.2 病原鑒定

1.2.1 病原菌的分離純化

采用組織分離法[8]分離純化病原菌。選取新鮮病樣清洗晾干，將病健交界處根組織剪成5 mm×5 mm小段，置入75%乙醇浸泡20 s，再于有效氯為3%～5%的次氯酸鈉溶液中消毒4～5 min，取出用無菌水漂洗3次并用無菌濾紙吸干多余水分后放于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。4～5 d后，挑取菌落邊緣的菌絲轉接至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。通過單孢分離技術進一步純化后，轉接至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待長出菌絲后，打菌餅保存于凍存管，置4 ℃冰箱備用[9]。

表1 供試藥劑一覽表

1.2.2 病原菌的致病性測定

病原菌致病性測定采用離體根部接種法[10]選取健康的一年生黨參幼根為接菌材料，將黨參根腐病病株上分離純化得到的病原物用打孔器打成菌餅，做刺傷接菌，以刺傷接PDA培養(yǎng)基為對照，各處理中每種分離物每個根上均勻接3個菌餅，每皿3根，3次重復，共27個接種點。接菌后將其置于紗布上，加入無菌水保濕，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且在保濕培養(yǎng)48 h后觀察記錄發(fā)病情況，并于接菌后第7 天統(tǒng)計發(fā)病率。待植株發(fā)病后，依據柯赫氏法則將發(fā)病部位再次進行分離培養(yǎng)，最后通過培養(yǎng)形狀觀察和普通顯微鏡鏡檢觀察確定分離得到的病原菌與初接病原菌是否為同一病菌。

1.2.3 病原菌形態(tài)學觀測

將病原菌在PDA平板上活化5 d后，挑取菌絲接種于CLA平板上。25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d后，挑取菌絲制作臨時玻片， 觀察大型分生孢子、小型分生孢子的形態(tài)特征，包括形狀、著生方式、隔膜數目與孢子大小，產孢方式(單瓶梗還是復瓶梗)，厚垣孢子形態(tài)特征。形態(tài)學鑒定參考Leslie等[11]的鐮刀菌分類系統(tǒng)和魏景超[12]的真菌鑒定方法。

1.2.4 病原菌的分子生物學特征分析

基因組DNA提取：分別刮取在PDA平板上培養(yǎng)7 d的病原菌菌絲，采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒按說明書操作提取基因組DNA[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

PCR擴增：TEF-1α序列采用通用引物TEF1(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)和TEF2(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)進行擴增。引物由西安擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

擴增體系為:模板DNA 1 μL，上游引物(10 μmol·L-1)和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，PCRTaqMix(Taqpolymerase、dNTP、2×PCR buffer)13 μL，ddH2O 9 μL。

擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[13]。

電泳檢測與測序：PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接送西安擎科新業(yè)生物技術有限公司測序。

序列分析：測序結果在 NCBI 網站進行 BLAST 比對，根據比對結果從GenBank數據庫獲得同源性較高的序列，用 MEGA 6.0 和 DNAMAN 軟件進行多序列比對分析，構建系統(tǒng)進化樹并分析親緣關系，確定病原菌的分類地位[14]。

1.3 病原菌室內藥劑毒力測定

1.3.1 供試藥劑濃度設置

供試藥劑與濃度設置如表2所示。

1.3.2 室內毒力測定方法

采用生長速率法[15-16]將不同質量濃度梯度處理的藥劑分別制成含毒介質培養(yǎng)基平板，以加無菌水為對照，接種菌株DS-1、DS-2。在無菌條件下用打孔器(菌餅直徑0.5 cm)于距菌落邊緣0.5 cm處打取菌餅，將1個菌餅移入含藥PDA平皿中央(菌絲面朝下)，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，待生長5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率[17]。根據殺菌劑質量濃度(g·L-1)對數值與抑制率機率值，計算各種藥劑對黨參根腐病病原菌劑量反應曲線的回歸方程與EC50值，比較各藥劑的相對抑制效果。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離頻率

表2 供試藥劑濃度設置

從供試的6份黨參病樣中共分離得到40株鐮孢菌，根據其在PDA上的培養(yǎng)形態(tài)進行初步分類，分離得到的鐮孢菌屬于2個種，其各自的分離頻率分別為：以菌株DS-1為代表性菌株的一類鐮孢菌為57.50%，以菌株DS-2為代表性菌株的一類鐮孢菌為42.50%。

2.2 病原菌的致病性測定

如圖1所示，接種菌株DS-1與菌株DS-2均可產生病斑，并且與黨參根腐病田間根部發(fā)病癥狀相似，空白對照未見癥狀。從接種后根部發(fā)病位點上均能夠再次分離得到先前接入的同種病菌，符合柯赫氏法則，說明以上2種菌均為黨參根腐病的致病菌。

接種2種鐮孢菌后第2天開始顯現病癥，其中，接種菌株DS-1的黨參根部表現為圓形或近圓形黑褐色病斑，接菌餅處有明顯的凹陷，部分腐爛裂開，呈黑褐色性病斑向周圍擴展，而且病斑面積均逐漸擴大。接種菌株DS-2的黨參根部表現為圓形或近圓形的紫紅色病斑，接菌處有明顯的凹陷，菌餅周圍無明顯變化；依據橫切面觀察，侵染致病的腐爛程度菌株DS-1要大于菌株DS-2。

2.3 病原菌的形態(tài)學特征

2.3.1 病原菌 DS-1的形態(tài)學特征

DS-1菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落生長迅速且均勻，菌絲繁茂，初期菌落呈現白色，后變?yōu)槟逃蜕?。從菌落背面觀察發(fā)現有明顯的同心圓，且層次中心部位顏色比邊緣深。在CLA培養(yǎng)基上對菌株DS-1培養(yǎng)15 d后，鏡檢觀察發(fā)現，菌絲有隔膜，隔膜間距約6.47～30.11 μm，菌絲寬1.40～4.65 μm，菌絲無色。大小型分生孢子同時產生(圖2-A)，產孢方式為單瓶梗產孢(圖2-B)。大型分生孢子鐮刀形，從中間向兩端逐漸變細，兩端鈍，有1～3個隔膜，多為3隔，孢子大小(10.99～16.31)μm×(2.09～3.14)μm。小型分生孢子卵圓形為主，0～1隔，多數1隔，大小(3.48～6.58)μm×(1.16～2.75)μm。厚垣孢子產于菌絲頂端或中間，球形，單生，壁厚且外壁粗糙(圖2-C)。依據上述特征，初步將菌株DS-1鑒定為茄鐮孢菌(Fusariumsolani)。

2.3.2 病原菌 DS-2的形態(tài)學特征

DS-2菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落生長較為緩慢但生長均勻，菌絲繁茂致密，初期菌落邊緣與上層菌絲為白色，菌落中心菌絲呈現淡黃色，后期期只有上層菌絲為白色其余都呈現桃紅色，從菌落背面觀察可見，從邊緣至中心顏色逐漸加深由白色到桃紅色再到深紅色的著色。通過在CLA培養(yǎng)基上對菌株DS-2培養(yǎng)15 d后，鏡檢觀察發(fā)現，菌絲有隔膜，隔膜間距6.32～33.83 μm，菌絲寬1.46～3.50 μm，無色或淡紅色。大、小型分生孢子和厚垣孢子混生，產孢方式為單瓶梗產孢(圖3-A)。大型分生孢子彎月形，兩端尖，有3～4個隔膜，孢子大小(8.90～13.56)μm×(1.60～3.03)μm(圖3-B)。小型分生孢子長橢圓形或卵形，孢子大小(5.60～8.50)μm×(1.49～3.00)μm(圖3-C)。厚垣孢子串生，淡紅色或無色，壁厚(圖3-D)。依據上述特征，將菌株DS-2初步鑒定為銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum)。

圖為接種病原菌后第7天的情況。A，菌株DS-1刺傷接菌根段表現癥狀情況；B，A的橫切面；C，菌株DS-2刺傷接菌根段表現癥狀情況；D，C的橫切面；E，PDA培養(yǎng)基刺傷根段表現癥狀情況(CK)；F，E的橫切面。The picture showed the situation on the 7th day after inoculation. A， The symptom of the mycorrhizal section of strain DS-1; B， The cross section of A; C， The symptom of the mycorrhizal section of strain DS-2; D， The cross section of C; E， The symptom of root segment stabbed by PDA medium (CK); F， The cross section of E.圖1 黨參根腐病致病性測定Fig.1 Pathogenicity of root rot on Codonopsis pilosula

A，大小型分生孢子；B，產孢結構；C，厚垣孢子。標尺為10 μm。A， Macroconidium and microconidium; B， Conidiogenous structure; C， Chlamydospore. Bar=10 μm.圖2 菌株DS-1形態(tài)學特征Fig.2 Morphological characteristics of strain DS-1

2.4 根腐病病原物分子生物學特征分析

擴增條帶長度大小為600 bp，由圖4可知，菌株DS-1的TEF-1α序列與寄生在木麻黃上的茄鐮孢菌F.solani(KX523136)遺傳距離較小，同源性為99.57%，親緣關系較近，兩者TEF-1α序列緊密聚集成一支。菌株DS-2的TEF-1α序列列與寄生在小麥上的銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)(MG654465)遺傳距離較小，同源性為99.70%，親緣關系較近，兩者TEF-1α序列緊密聚集成一支。因此，將甘肅省渭源縣黨參根腐病的病原物分別鑒定為茄鐮孢菌(F.solani)和銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)。

A，產孢細胞；B，大型分生孢子；C，厚垣孢子；D，小型分生孢子。標尺為10 μm。A， Conidiogenous structure; B， Macroconidium; C， Chlamydospore; D， Microconidium. Bar=10 μm.圖3 菌株DS-2形態(tài)學特征Fig.3 Morphological characteristics of strain DS-2

2.5 殺菌劑對病原菌的毒力測定結果

2.5.1 殺菌劑對DS-1的毒力測定結果

根據對DS-1的室內毒力測定結果得到毒力回歸方程(表3) 。6種殺菌劑對DS-1有不同程度的毒力作用，其中25%腈菌唑乳油和50%多菌靈可濕性粉劑的抑制作用最強，EC50分別為0.005 2 g·L-1和0.042 0 g·L-1；其余 4 種殺菌劑對DS-1也具有一定的抑制作用，EC50為0.283 4～1.725 4 g·L-1。

2.5.2 殺菌劑對DS-2的毒力測定結果

根據對DS-2的室內毒力測定結果得到毒力回歸方程 (表4) 。6種殺菌劑對DS-2有不同程度的毒力作用，其中50%多菌靈可濕性粉劑和50%福美雙可濕性粉劑的毒力作用最強，EC50分別為0.003 1 g·L-1和0.008 8 g·L-1，其余 4 種殺菌劑對DS-2也具有一定的抑制作用，EC50為0.014 2～0.400 9 g·L-1。

綜上，根據殺菌劑對2種黨參根腐病菌的毒力測定試驗，參試的6種藥劑均對其有抑制效果，其中25%腈菌唑乳油和50%多菌靈可濕性粉劑對黨參根腐病菌絲生長具有較好的防治效果(EC50<0.05 g·L-1)。

3 結論與討論

在病原菌鑒定方面，從甘肅省渭源縣黨參根腐病株上共分離得到40株致病菌株。通過該病原菌的致病性測定、形態(tài)學觀察和編碼轉錄延伸因子區(qū)序列(TEF-1α)聚類分析，將其鑒定為2個種，分別為茄鐮孢菌(F.solani)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)，其中茄鐮孢菌(F.solani)的分離頻率較高，為57.50%。目前已報道的引起黨參根腐病的主要病原菌有尖孢鐮孢菌[5-7，18]、柱孢菌[5]、莖點霉菌、紅核菌、白絹菌[19]與銳頂鐮孢菌[7]，其中鐮孢菌屬(Fusarium)真菌是引起黨參根腐病的主要類群，其多個種均可引起黨參發(fā)生根腐病。然而由于地域環(huán)境、生態(tài)條件等的不同或變化，不同地區(qū)病原種類和優(yōu)勢致病菌存在差異[20]。據趙純森等[5]研究發(fā)現，引起湖北黨參“慢性型”根腐病的主要病原菌為尖鐮孢菌(F.oxysporumSchl.)，而引起黨參“急性型”根腐病的主要病原菌為柱孢菌(Cylindrocaponsp.)；王艷等[3]研究發(fā)現，甘肅渭源、隴西縣黨參根腐病的病原菌為尖孢鐮孢菌(F.oxysporumSchl.)；孫新榮等[7]對甘肅渭源縣的黨參根腐病進行研究，發(fā)現引起黨參“急性青枯型”根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)，而引起黨參“慢性黃腐型”根腐病的主要病原菌為銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)；隨后，相關研究[6，21]相繼報道了此病害，但病原均為尖鐮孢菌(F.oxysporumSchl.)；而龍合正等[19]則認為貴州省畢節(jié)市威寧縣的黨參根腐病是由鐮刀菌、莖點霉菌、絲核菌、白絹菌等多種真菌和細菌單獨或復合侵染造成的。本實驗分離并鑒定出的黨參根腐病病原菌為茄鐮孢菌和銳頂鐮孢菌，這與前人的研究結果略有不同，推測一方面這與鐮孢菌種群的地理分布、常年連茬種植的栽培制度有關，另一方面與根腐病為復合侵染型病害有關。

圖4 根據TEF-1α序列構建的黨參根腐病病原菌聚類分析樹狀圖Fig.4 Tree clustering analysis of pathogens of Codonopsis pilosula root rot based on TEF-1α sequence

表3 殺菌劑對DS-1的毒力回歸方程

表4 殺菌劑對DS-2的毒力回歸方程

毒力回歸方程能有效反映不同濃度殺菌劑與抑菌效果的關系，EC50表示抑制50%目標菌所需殺菌劑濃度，是衡量殺菌劑毒力強弱最可靠的標準[22]。在室內毒力測定方面，本實驗通過6種殺菌劑對黨參根腐病的2株代表性致病菌進行毒力測定。結果表明，25%腈菌唑乳油和50%多菌靈可濕性粉劑對于防治DS-1茄鐮孢菌效果最佳，EC50分別為0.005 2和0.042 0 g·L-1；50%多菌靈可濕性粉劑和50%福美雙可濕性粉劑對于防治DS-2銳頂鐮孢菌效果最佳，EC50分別為0.003 1和0.008 8 g·L-1。本試驗中，2種病原菌對6種藥劑的敏感性存在差異， 其中對50%多菌靈可濕性粉劑和25%腈菌唑乳油較為敏感，對其余4種藥劑的敏感度較低。因此，50%多菌靈可濕性粉劑和25%腈菌唑乳油對黨參根腐病有較好的防治效果，建議在生產中交替使用以減弱黨參抗藥性的產生。

在實際生產中，由于田間病害的發(fā)生環(huán)境難以控制，同時黨參根腐病的發(fā)生情況比較復雜，存在復合侵染。因此，針對黨參根腐病，應該采取綜合防治措施，選育和合理選用抗病品種，合理施肥，增施磷、鉀肥，提高黨參對根腐病的抗性。黨參根腐病的病原物種類較多，廣譜性殺菌劑用于土壤處理時更有利于減輕病害發(fā)生。另外，適當選擇一些非寄主植物進行輪作倒茬，避免單一品種大面積種植，也是減輕黨參根腐病發(fā)生的有效途徑[23]。