唐 標(biāo)，常 江，2，胡 驥，錢鳴蓉，夏效東，楊 華，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室(籌)，b農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 2.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性是公共衛(wèi)生安全的重要威脅[1-3]，特別是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (ESBL)和碳青霉烯酶的出現(xiàn)給醫(yī)院感染的治療帶來了挑戰(zhàn)[4-6]。黏菌素是治療碳青霉烯類耐藥菌感染的最后一線藥物之一[7-9]。以往認(rèn)為黏菌素的抗性由染色體介導(dǎo)，且不易水平傳播。直到2015年11月，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)團隊在來自食品動物和臨床患者的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等中檢測到一種新的由質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1[8]。攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒具有接合轉(zhuǎn)移能力，有助于黏菌素耐藥性穩(wěn)定持久的傳播。隨后，許多國家陸續(xù)報道了攜帶mcr-1基因質(zhì)粒的革蘭氏陰性菌，這些菌對公眾健康造成了重大威脅[10-16]。目前質(zhì)粒的報道主要集中在質(zhì)粒草圖水平上，側(cè)重于mcr基因的基因環(huán)境分析，質(zhì)粒的完成圖報道占比相對較少[17]。近年來，黏菌素在畜禽養(yǎng)殖中作為促生長藥物被禁用[18]，動物源細(xì)菌對黏菌素的耐藥率隨之持續(xù)下降，但是耐藥率仍維持在5%[19]。本文對攜帶mcr基因的質(zhì)粒完成圖和相關(guān)耐藥基因進行了系統(tǒng)的回顧，共分析了2015—2018年GenBank收錄的103個完整的質(zhì)粒序列，對mcr及其在質(zhì)粒上的共存基因進行總結(jié)，這有助于深入了解黏菌素耐藥性持久傳播的原因。

1 質(zhì)粒圖譜

2015—2018年公布的103個攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒分布在五大洲的20個國家。其中，從中國不同樣本中分離到51個質(zhì)粒，占總數(shù)的49.5%(圖1)。這些質(zhì)粒存在于6種菌株中，其中多為腸桿菌科(圖2)，大腸埃希菌占76.7%，沙門氏菌占8.7%。這些質(zhì)粒的長度介于15～260 kb，60 kb的質(zhì)粒占比最高(圖3)；最大的是質(zhì)粒p100R(NCBI登錄號：KY689633)，達256 260 bp[20]；最小的是未命名的質(zhì)粒unamed1(NCBI登錄號：KX528699)，為15 998 bp[21]。這些質(zhì)粒至少可以劃分為7種不同的復(fù)制子類型，包括IncHI2、IncHI1A、IncN、IncFII、IncI2、IncX4、IncP1，與Wang等的報道一致[22]，其中IncI2占比最高，為50.5%；其次為IncX4，占比為24.3%。IncHI2類型的質(zhì)粒較大，通常在200 kb左右[23]；IncX4質(zhì)粒大小為33 kb左右[24-25]。質(zhì)粒復(fù)制子類型與多重耐藥菌株、細(xì)菌性疾病暴發(fā)有密切關(guān)系[26]。mcr質(zhì)粒復(fù)制子類型以IncI2和IncX4為主，推測這2種類型質(zhì)粒更能適應(yīng)宿主傳播。IncHI2質(zhì)粒容易攜帶多重耐藥基因，我們之前對攜帶mcr-1的IncHI2質(zhì)粒進行的比對研究，也發(fā)現(xiàn)了該類型質(zhì)粒有多重耐藥基因可變區(qū)[10]。IncX4質(zhì)粒比較保守，結(jié)構(gòu)沒有變化，僅有SNP差異[10]。

圖1 103個攜帶mcr基因質(zhì)粒的地域來源Fig.1 Geographical origin of 103 plasmids carrying mcr gene

圖2 103個攜帶mcr基因質(zhì)粒的宿主Fig.2 Hosts of 103 plasmids carrying mcr gene

圖3 103個攜帶mcr基因質(zhì)粒的復(fù)制類型分布Fig.3 Distribution of replication type of 103 plasmids carrying mcr gene

2 質(zhì)粒耐藥基因

通過resfinder軟件分析[27]發(fā)現(xiàn)，共25個質(zhì)粒攜帶其他獲得性耐藥基因，每個質(zhì)粒平均有6.52個耐藥基因。其中pHNSHP45-2(NCBI登錄號：KU341381)[9]的耐藥基因最多，有16個；其次是pXGE1mcr(NCBI登錄號：KY990887)[28]、p100R(NCBI登錄號：KY689633)[20]和pEC2-4(NCBI登錄號：CP016184)，均有15個耐藥基因，pMR0516mcr(NCBI登錄號：KX276657)[29]和pECJS-59-244(NCBI登錄號：KX084394)[30]質(zhì)粒均有14個耐藥基因(圖4)。pHNSHP45-2的耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺類(blaCTX-M-14)、氟苯尼考(floR，cmlA1)、磺胺類(sul1、sul2、sul3)、氨基糖苷類[aadA1、aadA2、aph(3′)-Ia、aac(3)-Iva、aph(4)-Ia]、氟喹諾酮(oqxA、oqxB)、磷霉素(fosA3)和甲氧芐啶(dfrA12)等；質(zhì)粒pXGE1mcr(NCBI登錄號：KY990887)上存在β-內(nèi)酰胺類(blaCTX-M-14)、氟苯尼考(floR，cmlA1)、磺胺類(sul1、sul2、sul3)、氨基糖苷類[aadA1、aadA2、aph(3′)-Ia、aac(3)-Iva、aph(4)-Ia]、磷霉素(fosA3)、甲氧芐啶(dfrA12)、MLS[大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈霉菌素B，mph(A)][28]等耐藥基因。

在所有多重耐藥質(zhì)粒中共預(yù)測到35種耐藥基因，能夠介導(dǎo)10種耐藥表型(圖5)。除黏菌素外，以上103個質(zhì)粒上β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類耐藥基因共存的數(shù)量最多，分別為18個、15個和13個。具體到基因來看，除了mcr基因，攜帶sul3和aadA1基因的質(zhì)粒數(shù)量最多，均為11個(圖6)。黏菌素和碳青霉烯類抗生素是臨床治療腸桿菌科感染的最后一線藥物，而值得注意的是IncX4型質(zhì)粒pCQ02-121(NCBI登錄號：KU647721)同時攜帶了碳青霉烯類耐藥基因blaNDM-5，因此具有較大的公共衛(wèi)生安全風(fēng)險。

圖5 103個mcr質(zhì)粒所攜帶耐藥基因介導(dǎo)的耐藥表型Fig.5 Drug resistance phenotypes mediated by 103 plasmids carrying mcr gene

圖6 103個mcr質(zhì)粒所含耐藥基因數(shù)量Fig.6 Numbers of antimicrobial resistance genes in 103 plasmids carrying mcr gene

3 抗消毒劑和抗重金屬基因

基于BacMet數(shù)據(jù)庫[31]分析發(fā)現(xiàn)，編碼抗消毒劑和抗重金屬的基因在以上103個質(zhì)粒中分布廣泛。預(yù)測結(jié)果表明，95.14%的質(zhì)粒含有抗消毒劑和重金屬抗性基因，例如抗三氯生(Triclosan)基因triA-triC、oqxB，抗十二烷基磺酸鈉基因ydeO，抗西曲溴銨(Cetrimide)基因qacF，抗銅基因dsbC，抗汞基因merA，抗錳基因sitA-sitC，抗碲基因terA-terC、terW、terZ等。不同質(zhì)粒上含有的抗性基因數(shù)量分布不均等。在所有檢測到的抗性基因中，碲和三氯生抗性基因占預(yù)測總抗性基因的93%以上。此外，有些質(zhì)粒存在多個抗性基因(圖7)，例如，質(zhì)粒pICBEC72Hmcr(NCBI登錄號：CP015977)攜帶多個三氯生抗性基因[32]，質(zhì)粒pSA26-MCR-1(NCBI登錄號：KU743384)攜帶多個碲抗性基因[33]，質(zhì)粒pMR0516mcr(NCBI登錄號：KX276657)攜帶抗錳、鐵和過氧化氫的基因簇等。

4 可移動元件與接合轉(zhuǎn)移能力分析

可移動元件是驅(qū)動獲得性耐藥基因在人和動物中傳播的重要因素[34]。插入序列通過ISfinder進行預(yù)測[35]，在所有質(zhì)粒中共檢測到35種轉(zhuǎn)座子或插入序列(圖8)，表明這些質(zhì)粒的耐藥基因具有傳播到其他細(xì)菌的潛力[36]。其中，在38個質(zhì)粒中檢測到ISApl1和IS26，占比均為37.9%。據(jù)報道，ISAspl1對mcr-1的傳播有重要影響[37]。從此次分析結(jié)果來看，IS26在以上質(zhì)粒中出現(xiàn)的概率較高。IS26是一種常見的轉(zhuǎn)座酶，與細(xì)菌耐藥性具有較強的相關(guān)性[38]，并在獲得抗生素耐藥性中發(fā)揮作用，其在黏菌素耐藥性傳播中的作用有待進一步研究。使用oriTfinder預(yù)測[39]發(fā)現(xiàn)，在103個攜帶mcr基因質(zhì)粒中，18.45% (19/103)具有完整的IV型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)移元件，包括接合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移位點(oriT)、松弛酶(relaxase)、耦聯(lián)蛋白(T4CP)和T4SS，表明其具有較強的接合轉(zhuǎn)移能力[39-40]。最先報道的IncHI2型質(zhì)粒pHNSHP45-2包含完整的接合轉(zhuǎn)移元件，且至今仍不斷分離檢測到該類型的mcr-1基因攜帶質(zhì)粒，這表明其傳播mcr-1基因和其他抗性基因的風(fēng)險較高[41-42]。從本研究結(jié)果來看，多數(shù)質(zhì)粒都具有oriT區(qū)域，表明這些質(zhì)粒具有潛在的接合轉(zhuǎn)移能力，是促進黏菌素耐藥性傳播的危險因素?？梢苿釉軌驍y帶耐藥基因造成水平轉(zhuǎn)移，并可以跨種屬傳播；而接合轉(zhuǎn)移是完整質(zhì)粒向其他細(xì)菌發(fā)生的滾環(huán)復(fù)制現(xiàn)象，往往發(fā)生在種間或?qū)匍g。綜上，mcr質(zhì)粒具有豐富的可移動元件和接合轉(zhuǎn)移元件，在選擇壓力下，較容易發(fā)生傳播和變異。

圖7 103個mcr質(zhì)粒所攜帶的消毒劑和重金屬抗性基因數(shù)量Fig.7 Numbers of antibacterial biocide and heavy metal-resistance genes in 103 plasmids carrying mcr gene

圖8 103個mcr質(zhì)粒中的可移動元件數(shù)量Fig.8 Numbers of mobile elements in 103 plasmids carrying mcr gene

5 討論與展望

本研究采用系列生物信息學(xué)預(yù)測來描述攜帶mcr及其相關(guān)基因且具有完成圖的質(zhì)粒的基本特征，預(yù)測了可能影響?zhàn)ぞ啬退幮詡鞑サ馁|(zhì)粒共性因素。在耐藥基因中，sul3、aadA1、aadA2、tet(A)與黏菌素抗性基因mcr有很高的共存率；在耐藥基因型上，攜帶mcr-1的多重耐藥質(zhì)粒對β-內(nèi)酰胺類抗生素有較高的耐藥率。這與以上抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的大量使用有關(guān)[43-45]。在中國的畜禽養(yǎng)殖中，抗生素大量用于治療細(xì)菌感染[23]，為了滿足畜禽養(yǎng)殖業(yè)對畜禽產(chǎn)品的高需求，抗生素常被用作飼料添加劑。這些耐藥基因型和黏菌素耐藥性的高共存率表明，通過持續(xù)使用相應(yīng)的抗生素，有可能實現(xiàn)細(xì)菌對黏菌素耐藥性的共同選擇。其結(jié)果是在缺乏黏菌素選擇壓力的情況下，攜帶黏菌素基因的質(zhì)粒持續(xù)存在并傳遞。所以，最先報道的IncHI2質(zhì)粒pHNSHP45-2含有16種耐藥基因和8種耐藥表型，隨后攜帶mcr-1基因的IncHI2質(zhì)粒被陸續(xù)分離出來[41，46-48]。

消毒劑和金屬抗性基因可以共同選擇抗生素耐藥性[49]，這增加了抗生素耐藥性傳播的風(fēng)險。一些重金屬被用作畜禽養(yǎng)殖的飼料添加劑，促進動物生長[50]。例如，銅、鋅常被用作飼料補充劑[51-52]，這可能加劇動物源細(xì)菌的抗生素耐藥性[52]。黏土是一種含有多種金屬元素的新型飼料添加劑，其具有促進動物生長、減少真菌污染的作用，在食品動物育種中得到了廣泛使用[53]。另外，黏土中的金屬元素含量，如砷、鉛、鎘和氟含量，遠遠高于正常水平[54-55]。本研究在大部分?jǐn)y帶mcr基因的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了消毒劑和重金屬抗性基因，這表明相關(guān)基因和黏菌素耐藥基因存在共選擇的風(fēng)險。在控制黏菌素耐藥性水平時，應(yīng)將重金屬耐藥耦合因素考慮其中，減少飼料中重金屬的添加。

2017年，黏菌素已被禁止用于飼料中，但是2020年仍陸續(xù)有關(guān)于mcr-1攜帶質(zhì)粒的報道[19]。本研究結(jié)果表明，攜帶mcr的質(zhì)粒具有很強的傳播能力，可能與抗生素耐藥基因和抗重金屬基因等危險因素共同選擇。因此，本研究結(jié)果將有助于更好地研究黏菌素耐藥性的持續(xù)傳播因素。由于mcr質(zhì)粒序列的報道呈爆發(fā)性增長，下一步可以結(jié)合更多的序列數(shù)據(jù)進行mcr質(zhì)粒的流行性和特征分析，挖掘更詳盡的質(zhì)粒特征。動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測是研究耐藥水平變化的基礎(chǔ)，未來應(yīng)持續(xù)進行黏菌素耐藥性監(jiān)測并關(guān)注mcr基因的陽性率變化趨勢；另一方面，要篩選黏菌素耐藥菌，并進行基因組完成圖測序，長期研究mcr質(zhì)粒的流行性和特征變化。在我國，畜禽養(yǎng)殖中“飼料環(huán)?；?減少重金屬添加)與“獸用抗生素減量化”(禁用、少用抗生素)是大勢所趨，相信在政府的雙重施策下，動物源細(xì)菌耐藥性會得到更有效的控制。