劉金玉，黃 鷹

(1.長江大學 生命科學學院，湖北 荊州434025； 2.南京師范大學 生命科學學院，江蘇 南京210023)

tRNA在蛋白質(zhì)合成過程中起著極其重要的作用。生物體內(nèi)的tRNA首先以前體形式轉(zhuǎn)錄而成，經(jīng)過一系列加工后才能成為有生物學功能的成熟tRNA分子；這些加工包括除去5′前導(dǎo)序列、3′末端序列，切除內(nèi)含子，修飾堿基和添加3′末端CCA[1]。tRNA前體加工的主要核酸內(nèi)切酶是RNase P、tRNase Z和tRNA內(nèi)切酶，其分別參與tRNA前體5′前導(dǎo)序列、tRNA前體3′末端序列和內(nèi)含子剪接的加工[2-4]。tRNase Z是一種參與tRNA前體3′末端加工的核酸內(nèi)切酶，屬于金屬內(nèi)酰胺酶超家族中的ElaC亞家族成員[5]。許多細菌、大多數(shù)真核生物，以及所有古生菌的tRNA前體3′末端加工過程都是由核酸內(nèi)切酶tRNase Z催化的[6-8]。根據(jù)氨基酸序列數(shù)目的不同，tRNase Z可分為短型tRNase ZS和長型tRNase ZL。短型tRNase ZS有280～360個氨基酸殘基，長型tRNase ZL有750～930個氨基酸殘基[9]。短型tRNase ZS存在于細菌、真核生物和古生菌，而長型tRNase ZL僅發(fā)現(xiàn)存在于真核生物。不同生物體中存在不同種類和不同數(shù)目的tRNase Z。如芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)和果蠅(Drosophilamelanogaster)都只有1個長型tRNase ZL[10-11]；而人有2個tRNase Z，其中1個是短型tRNase ZS，也叫ELAC1，另1個是長型tRNase ZL，也叫ELAC2。人ELAC2基因最初是作為家族性前列腺癌易感基因被發(fā)現(xiàn)的，但其突變增加家族性前列腺癌的機制并不清楚[8-9]。粟酒裂殖酵母存在2個tRNase ZL基因，分別為sptrz1和sptrz2，它們是必需基因；sptrz1和sptrz2編碼的蛋白(SpTrz1和SpTrz2)與人ELAC2高度同源，分別參與核和線粒體tRNA前體3′末端加工[12]。

目前認為，長型tRNase ZL是在進化中通過短型tRNase ZS的基因復(fù)制(duplication)形成的[13-14]。長型tRNase ZL可分為C-末端一半和N-末端一半。tRNase ZL序列的C-末端一半很少分化，而N-末端一半分化程度很高。長型tRNase ZL的C-末端一半主要保留了酶的催化功能，它含有5個高度保守的模體(模體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)，其中模體Ⅱ也稱組氨酸模體，序列為HxHxDH(x代表任意疏水性氨基酸殘基)，是tRNase Z最具標識的模體。tRNase ZL序列的C-末端一半和短型tRNase ZS的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)有較高的相似性。而長型tRNase ZL的N-末端一半主要保留了ZiPD(zinc-dependent phosphodiesterase)類型的底物結(jié)合功能，它含有1個假模體Ⅱ和一個可變臂，其中假模體Ⅱ也稱假組氨酸模體，且與短型tRNase ZS在蛋白一級結(jié)構(gòu)上有較低的相似性。

本實驗克隆表達了粟酒裂殖酵母線粒體tRNA 3′末端加工酶SpTrz2的全長和N-末端一半，并制備SpTrz2和SpTrz2 N-末端一半(SpTrz2N)的多克隆抗體，為檢測粟酒裂殖酵母SpTrz2的蛋白水平和進一步明確SpTrz2的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

粟酒裂殖酵母單倍體野生型菌株yAS56[(h+，尿嘧啶生物合成缺陷型(ura4-D18)，亮氨酸生物合成缺陷型(leu1-32)]、大腸埃希菌Top10、BL21(DE3)和表達載體pET28a(+)均為本實驗室保存。PrimeSTAR高保真聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ，以及連接酶試劑盒和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA分子質(zhì)量標準購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA純化試劑盒、DNA割膠回收試劑盒和PCR過柱純化試劑盒購自博巧生物科技公司；酵母提取物和蛋白胨購自O(shè)XIOD公司；尿嘧啶、亮氨酸、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；其他常用試劑均購自南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

芽殖酵母ScTrz1、粟酒裂殖酵母SpTrz2、果蠅DmTrz1和人ELAC2的蛋白質(zhì)序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)，使用Clustal W軟件比對分析芽殖酵母ScTrz1、裂殖酵母SpTrz2、果蠅DmTrz1和人ELAC2的N-末端一半序列[15]。采用TMpred軟件分析裂殖酵母SpTrz2的跨膜結(jié)構(gòu)域；采用在線工具iedb預(yù)測SpTrz2的B細胞表位(http://www.iedb.org/)。

1.2.2 PCR片段擴增

利用Primer 6.0軟件分別設(shè)計擴增全長sptrz2和N-末端一半sptrz2N基因的特異性引物，如表1所示。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以粟酒裂殖酵母野生型yAS56基因組為模板擴增目的片段[16]。擴增條件為98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用PCR過柱純化試劑盒進行純化。

1.2.3 重組載體的構(gòu)建和鑒定

采用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)載體，把酶切產(chǎn)物按連接酶試劑盒說明的配比加入到酶連反應(yīng)體系，16 ℃連接6 h，將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Top10感受態(tài)細胞，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～15 h。挑取單菌落接種于5 mL含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。通過堿裂解法提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒分別進行PCR鑒定，并送南京思普金生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化

將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N分別轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，分別涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～15 h，得到重組原核表達菌株。分別挑單菌落接種于20 mL的LB液體培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1卡那霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h；將重組原核表達菌株分別轉(zhuǎn)接到200 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1卡那霉素)，使其D600為0.2，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；當D600達到0.6～0.7時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的作為陰性對照。4 ℃，8 000 ×g離心，PBS緩沖液(pH為7.4)懸浮洗滌，加入終濃度為0.1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)；4 ℃ 400 W超聲破碎，每次工作10 s，間隔10 s，直至破碎完全。4 ℃，12 000 ×g離心，收集上清和沉淀。裂解后的菌液、上清和沉淀分別與10×蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，通過12% SDS-PAGE電泳分析融合蛋白SpTrz2和SpTrz2N的表達與可溶性。

1.2.5 粟酒裂殖酵母線粒體的提取

將野生型yAS56菌株接種于20 mL YES液體培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)。10 h后轉(zhuǎn)接至500 mL YES液體培養(yǎng)基，使其D600為0.2，30 ℃振蕩培養(yǎng)7 h，離心收菌，ddH2O懸浮洗滌，5 000 ×g離心3 min，收集沉淀。50 mL S緩沖液(1.4 mol·L-1山梨醇，1.5 mmol·L-1氯化鎂，40 mmol·L-1HEPES)懸浮洗滌，5 000 ×g離心4 min，收集沉淀。50 mL S緩沖液重懸沉淀，30 ℃，10 min輕搖溫育，然后5 000 ×g離心5 min，收集沉淀，稱量，添加適量的S緩沖液，加裂解酶，振蕩孵育3 h，鏡檢破壁情況，5 000 ×g離心5 min，收集圓球形的原生質(zhì)體。后續(xù)步驟均在4 ℃條件下進行，加入預(yù)冷的勻漿緩沖液[600 mmol·L-1山梨醇，10 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.4)，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1PMSF]，用杜恩斯勻漿器勻漿10次，獲得的樣品即為全細胞蛋白(T)，4 000 ×g離心5 min，收集上清。12 000 ×g離心10 min收集上清(PMS，去除線粒體的上清)和沉淀。適量SEM緩沖液[250 mmol·L-1蔗糖，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1MOPS (pH 7.2)]重懸沉淀，12 000 ×g離心10 min收集沉淀。適量SEM緩沖液重懸沉淀，得到線粒體懸浮液(Mt，線粒體)。

1.2.6 多克隆抗體的制備與檢測

目的蛋白SpTrz2和SpTrz2N在大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)中主要以包涵體的形式存在。將包涵體蛋白SpTrz2和SpTrz2N分別進行12% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后分別切膠回收目的條帶，蛋白抗原(大于3 mg目的蛋白量，純度大于90%)適合多克隆抗體的制備。將純化得到的包涵體蛋白SpTrz2和SpTrz2N樣品作為抗原送至南京金斯瑞生物科技有限公司制備相應(yīng)的多克隆抗體。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測多克隆抗體的效價。提取yAS56裂殖酵母的全細胞蛋白(T)，去掉線粒體的上清蛋白(PMS)和線粒體蛋白(Mt)進行12% SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)；用封閉液(0.137 mol·L-1NaCl，0.02 mol·L-1Tris，50g·L-1脫脂奶粉)室溫封閉NC膜2 h；再用TBST緩沖液(0.137 mol·L-1NaCl，0.02 mol·L-1Tris，0.1% Tween 20)洗膜3次；按1∶3 000的比例加入一抗，室溫孵育4 h，用TBST緩沖液洗膜3次；再按1∶3 000的比例加入二抗(羊抗兔IgG熒光抗體)，室溫孵育1 h，用Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 粟酒裂殖酵母SpTrz2的N端同源性分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫下載芽殖酵母ScTrz1(登錄號：AHY76312.1)、粟酒裂殖酵母SpTrz2(登錄號：NP_595514.1)、果蠅DmTrz1(登錄號：NP_724916.1)和人ELAC2(登錄號：AAH01939.1)的氨基酸序列。粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的全長由678個氨基酸殘基組成，N-末端一半位于該蛋白的1～407位氨基酸處。借助Clustal W軟件對芽殖酵母ScTrz1蛋白、粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白、果蠅DmTrz1蛋白和人ELAC2蛋白的N-末端一半序列同源性進行比對分析，結(jié)果見圖1。

2.2 SpTrz2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

借助TMpred軟件對粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的跨膜情況進行分析，SpTrz2蛋白擁有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中，2個位于SpTrz2蛋白的N-末端一半序列(47～69位氨基酸和106～129位氨基酸)，第3個位于SpTrz2蛋白的C-末端一半序列(425～451位氨基酸)，結(jié)果見圖2。

2.3 SpTrz2的免疫原性預(yù)測

借助在線工具iedb預(yù)測SpTrz2蛋白N-末端一半和C-末端一半的B細胞抗原表位，結(jié)果見圖3。SpTrz2的N-末端一半和C-末端一半分別有14個和9個預(yù)測的B細胞抗原表位，它的氨基酸組成和分布見表2和表3。

2.4 重組質(zhì)粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N的構(gòu)建與鑒定

用PCR方法，以粟酒裂殖酵母野生型yAS56的基因組作為模板擴增，獲得了全長sptrz2和N-末端一半sptrz2N基因的PCR擴增產(chǎn)物，其大小分別為2 037 bp和1 221 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖4-A和4-B)。將獲得的sptrz2和sptrz2N基因分別克隆到pET28a(+)上。挑選重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，凝膠電泳結(jié)果分別與目的基因sptrz2和sptrz2N大小相符，測序結(jié)果表明獲得的sptrz2和sptrz2N基因序列正確(圖4-C和4-D)。表明重組質(zhì)粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N構(gòu)建成功，可用于誘導(dǎo)表達蛋白。

2.5 重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N的表達與可溶性分析

將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，37 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達4 h，進行SDS-PAGE電泳分析。重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N主要以包涵體的形式高效表達，上清中也有少量表達，其相對分子質(zhì)量分別為75.99 ku和44.77 ku，與預(yù)期結(jié)果一致(圖5-A和5-B)。用SDS-PAGE電泳切膠的方法處理包涵體SpTrz2和SpTrz2N，得到純化的重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N。

2.6 多克隆抗體的制備與特異性分析

將純化后的重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N送至南京金斯瑞生物科技有限公司制備多克隆抗體。分別提取粟酒裂殖酵母野生型yAS56的全細胞蛋白，去除線粒體的上清和線粒體后進行Western blotting鑒定。以2次免疫后獲得的抗SpTrz2和SpTrz2N的兔源血清抗體作為一抗，以抗Sla1抗體作為上樣控制一抗，羊抗兔IgG熒光抗體作為二抗進行Western blotting。實驗以已知定位于細胞核的Sla1作為對照。結(jié)果顯示，兔抗SpTrz2和SpTrz2N的多克隆抗體可以檢測到線粒體中的天然SpTrz2蛋白，說明制備的多克隆抗體具有SpTrz2蛋白特異性(圖6-A和6-B)。但全細胞蛋白和去除線粒體的上清蛋白樣品中幾乎檢測不到SpTrz2蛋白，這是由于SpTrz2蛋白在體內(nèi)表達量很低(圖6-A和6-B)。

圖2 SpTrz2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.2 Transmembrane domain of SpTrz2 protein

A，SpTrz2蛋白的N-末端一半的B細胞表位；B，SpTrz2蛋白C-末端一半的B細胞表位。A，The B cell epitopes in the N-terminal halve of SpTrz2 protein; B， The B cell epitopes in the C-terminal halve of SpTrz2 protein.圖3 SpTrz2蛋白的B細胞表位Fig.3 B cell epitopes in SpTrz2 protein

表2 SpTrz2 蛋白N端B細胞表位的氨基酸序列

表3 SpTrz2蛋白 C端B細胞表位的氨基酸序列

M，DNA分子質(zhì)量標準；1，sptrz2基因PCR擴增產(chǎn)物；2，sptrz2N基因PCR擴增產(chǎn)物；3～4，重組質(zhì)粒pET28a-sptrz2的PCR鑒定；5～6，重組質(zhì)粒pET28a-sptrz2N的PCR鑒定。M， DNA marker; 1， PCR product of sptrz2; 2， PCR product of sptrz2N; 3 and 4， Identification of recombinant plasmid pET28a-sptrz2 by PCR; 5 and 6， Identification of recombinant plasmid pET28a-spTrz2N by PCR.圖4 重組質(zhì)粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N的構(gòu)建Fig.4 Construction of recombinant plasmids of pET28a-sptrz2 and pET28a-sptrz2N

3 結(jié)論與討論

線粒體tRNase ZL除了參與線粒體RNA加工外，還與線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)的復(fù)合體合成有關(guān)。線粒體tRNase ZL功能異常使線粒體蛋白表達量降低，從而引起線粒體氧化磷酸化的異常，導(dǎo)致線粒體功能障礙[17-19]。許多人類疾病與線粒體功能障礙相關(guān)，例如肥厚性心肌病、聾癥、線粒體腦病和癌癥等[20]。在粟酒裂殖酵母中，SpTrz2蛋白參與線粒體的tRNA前體3′末端加工，還參與線粒體的mRNAs和rRNAs 5′末端的成熟加工[12，21]。許多研究表明，提高SpTrz2蛋白表達量會引起線粒體損傷，可能導(dǎo)致鐵穩(wěn)態(tài)，活性氧積累從而誘發(fā)凋亡性細胞死亡，但具體機制還需要深入研究[22]。因此，為了研究SpTrz2蛋白表達與線粒體tRNA 3′末端加工過程缺陷之間的關(guān)系，以及SpTrz2蛋白在細胞周期調(diào)控與細胞凋亡中的功能作用，需要建立SpTrz2蛋白的檢測工具。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，未經(jīng)誘導(dǎo)的SpTrz2重組菌株；2，IPTG誘導(dǎo)的SpTrz2重組菌株；3，誘導(dǎo)后的上清；4，誘導(dǎo)后的沉淀，箭頭標示重組蛋白SpTrz2；5，未經(jīng)誘導(dǎo)的SpTrz2N重組菌株；6，IPTG誘導(dǎo)的SpTrz2N重組菌株；7，誘導(dǎo)后的上清；8，誘導(dǎo)后的沉淀，箭頭標示重組蛋白SpTrz2N。M， Protein molecular weight marker; 1， SpTrz2 recombinant strain non-induced; 2， SpTrz2 recombinant strain induced with IPTG; 3， The supernatant of SpTrz2 recombinant strain induced with IPTG; 4， The pellet of SpTrz2 recombinant strain induced with IPTG， the arrow indicated recombinant protein SpTrz2; 5， SpTrz2N recombinant strain non-induced; 6， SpTrz2N recombinant strain induced with IPTG; 7， The supernatant of SpTrz2N recombinant strain induced with IPTG; 8， The pellet of SpTrz2N recombinant strain induced with IPTG， the arrow indicated recombinant protein SpTrz2N.圖5 重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of induced expression of recombinant protein SpTrz2 and SpTrz2N

T，全細胞蛋白；PMS，去除線粒體的上清；Mt，線粒體。T， Total cell extracts; PMS， Postmitochondrial supernatants; Mt， Mitochondria.圖6 SpTrz2和SpTrz2N多克隆抗體的Western blotting檢測Fig.6 Western blotting of polyclonal antibodies of SpTrz2 and SpTrz2N protein

在抗體的制備中，酵母表達系統(tǒng)能夠進行蛋白翻譯后加工，收獲的高表達外源蛋白具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，尤其適合于表達真核生物蛋白，這有利于保持外源蛋白的可溶性和活性[23-24]。然而酵母表達系統(tǒng)不適合用于高表達SpTrz2蛋白，因為課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高表達SpTrz2蛋白會導(dǎo)致酵母細胞的死亡[12]。大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)是生產(chǎn)重組蛋白的一種高效、廉價的表達體系，且其表達量遠大于酵母表達系統(tǒng)，但大腸埃希菌表達的基因工程真核蛋白一般以無生物活性的包涵體形式存在[25]。包涵體不僅容易進行有效的分離和純化，而且其對寄主細胞無毒性作用，因此本研究以大腸埃希菌作為宿主進行粟酒裂殖酵母重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N的異源表達。

本研究采用生物信息學方法分析SpTrz2蛋白的全長和N-末端一半，成功表達了重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N，并進行了純化和富集，得到大量高純度重組蛋白SpTrz2和SpTrz2N，且成功制備了兔抗SpTrz2和SpTrz2N的多克隆抗體。為了后續(xù)進一步研究由tRNase ZL和線粒體tRNA加工過程缺陷引發(fā)的疾病奠定了基礎(chǔ)。