韓玉梅，謝晶瑩，畢英杰，許淑娟，馮若飛

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030； 2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患病原體，感染后可引起動(dòng)物和人類發(fā)生腦炎和心肌炎，以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病和繁殖障礙等多種疾病[1]。2005年我國(guó)從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到EMCV，表明我國(guó)存在腦心肌炎病毒的感染[2]。另外，多個(gè)國(guó)家和地區(qū)曾相繼報(bào)道EMCV感染后引起腦心肌炎的流行和爆發(fā)，給世界畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。由于本病毒在豬和人之間有密切聯(lián)系，通過對(duì)人群進(jìn)行EMCV抗體檢測(cè)，證實(shí)人也可以感染EMCV[5]，因此認(rèn)為EMCV感染具有潛在的公共衛(wèi)生學(xué)意義。EMCV是一個(gè)無囊膜單股正鏈的小RNA病毒，病毒衣殼由4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中VP1位于病毒粒子最表面，抗原性最強(qiáng)，且與病毒的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、受體吸附和脫殼有關(guān)[6-7]。

天然免疫是機(jī)體進(jìn)化過程中形成的免疫防御機(jī)制，是機(jī)體自我保護(hù)的第一道防線，也是獲得性免疫的基礎(chǔ)。病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)是最早被觸發(fā)的機(jī)制，主要識(shí)別的是病毒的核酸或病毒感染過程中產(chǎn)生的核酸類似物。這些PAMP可被宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別，誘發(fā)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)限制病毒的增殖和傳播。

病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，病毒的核酸可以被Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs，如TLR3、7和9)、RIG-I樣受體(RIG-I like receptors，RLRs，如RIG-I和MDA5)和近年來發(fā)現(xiàn)的DNA受體(deoxyribonucleic acid like receptors，如DAI和IFI16)識(shí)別。其中，RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(melanoma differentiation associated protein 5)是相似的兩種受體，識(shí)別不同種類的病毒RNA，它們有著相同的下游信號(hào)分子MAVS(mitochondrial antiviral signaling)[8-9]。RIG-I和MDA5識(shí)別TRAF2/6(TNF receptor associated factor 2/6)活化IKK(IκB kinase)激酶復(fù)合物，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)；另一方面通過招募TRAF3和TBK1(TANK binding kinase 1)，促進(jìn)IRF3的磷酸化[10-11]?；罨霓D(zhuǎn)錄因子NF-κB和IRF3(interferon response factor 3)進(jìn)入細(xì)胞核后，協(xié)同促進(jìn)Ⅰ型干擾素基因的表達(dá)。此外，感染病毒后，接頭蛋白STING(stimulator of interferon genes)與MAVS相互作用，招募TBK1(TANK binding kinase 1)，通過自身寡聚化形成MAVS-STING-TBK1-IRF3復(fù)合物， 促進(jìn)TBK1對(duì)IRF3的磷酸化激活，從而介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)[12-13]，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[14-15]。然而，病毒在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，為了自身繁殖，通過多種策略來抑制或逃避宿主天然免疫應(yīng)答，不同病毒蛋白能夠通過不同方式拮抗天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而有效促進(jìn)自身在宿主細(xì)胞中的復(fù)制[16-17]。

對(duì)口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的研究表明，VP1可通過與可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白結(jié)合抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)[18]，EMCV作為與FMDV具有相似結(jié)構(gòu)的病毒，其VP1的研究多集中于疫苗領(lǐng)域，其與宿主蛋白的反應(yīng)及參與干擾素信號(hào)通路的研究尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建EMCV VP1真核表達(dá)載體，探索其對(duì)病毒增殖和干擾素信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與毒株

人胚腎細(xì)胞HEK293、豬腎細(xì)胞PK 15、EMCV PV21株(登錄號(hào)：X74312)均由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白酶、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和新生牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；Trans-Blot Turbo Mini-size Transfer Stacks購(gòu)自BIO-RAD公司；細(xì)胞總RNA提取試劑RNAiso plus、LA-Taq聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、pMD-18T vector購(gòu)自TaKaRa公司；隨機(jī)引物、DEPC水購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；SYBR Green購(gòu)自ABI公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；Opti-MEM購(gòu)自Gibco公司；鼠抗HA標(biāo)簽多克隆抗體購(gòu)自北京全式金公司，鼠抗β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；山羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Jackson公司；Hyper Singal高敏ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自四正柏公司；RIPA細(xì)胞裂解液及PMSF蛋白保護(hù)劑均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞BL21、pCMV-HA載體由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 pCMV-HA-VP1表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

根據(jù)GenBank公布的EMCV(登錄號(hào)：X74312)序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì) VP1基因的表達(dá)引物，上下游分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BglⅡ，正向序列為5′-GGAATTCGGATGGGAGTAGAAAACGCTGAAAAAG-3′；反向序列為5′-GAAGATCTTCACTCTAGCATCAAGACTCCAGC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。應(yīng)用RNA提取試劑盒提取EMCV的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。目的基因與載體pCMV-HA連接成功后送至西安擎科生物技術(shù)股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCMV-HA-VP1。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

分別將HEK293和PK-15細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent將重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1 和空載質(zhì)粒pCMV-HA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，36 h后收集細(xì)胞檢測(cè)VP1表達(dá)。一抗為鼠抗HA多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；二抗為山羊抗鼠IgG-HRP，室溫孵育1 h，洗膜后，ECL顯色。

1.2.3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)

分別用pCMV-HA-VP1和pCMV-HA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入70%丙酮(預(yù)冷)固定15 min，之后棄去固定液并加封閉液于37 ℃孵育1 h；棄去封閉液后加入鼠抗HA 抗體；PBS 洗4次，每次5 min，再加入山羊抗鼠IgG(Dylight594)二抗，37 ℃避光孵育1 h；PBS洗3次，每次5 min，進(jìn)行DAPI染核，避光染色5 min，用PBS洗2次后加入抗淬滅熒光衰減封片劑封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)

將重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1和空載質(zhì)粒pCMV-HA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h按100 TCID50感染EMCV，感染36 h后收集細(xì)胞，通過TRIZol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后利用本課題組前期建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法進(jìn)行病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)[19]。所需引物及探針序列見表1。

1.2.5 病毒感染力的測(cè)定(TCID50)

將HEK293細(xì)胞鋪在96孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到95%融合度時(shí)進(jìn)行接毒。將前期轉(zhuǎn)染VP1重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒感染EMCV后收集的培養(yǎng)上清用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋，即10-1、10-2……10-11，然后每孔加入100 μL病毒懸液，37 ℃孵育2 h后棄去毒液，無血清培養(yǎng)基清洗3次后，每孔補(bǔ)加200 μL含3%NBS DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在24、48、72、96和120 h觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞病變結(jié)果，每個(gè)病毒稀釋度做8個(gè)重復(fù)。根據(jù)96孔板細(xì)胞病變孔數(shù)判定毒價(jià)，重復(fù)3次。最后根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算TCID50毒價(jià)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IFN-β與通路相關(guān)因子mRNA水平

用1 μg重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1和空載質(zhì)粒pCMV-HA分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后按100 TCID50感染(或未感染)EMCV，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后分別收集上清和細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)TRIzol提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)IFN-β與RLRs信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平，相關(guān)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表2。

表1 EMCV TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及探針

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.7 ELISA檢測(cè)IFN-β表達(dá)

參照ELISA試劑盒相關(guān)操作說明檢測(cè)上述實(shí)驗(yàn)收集的細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-β的含量。用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和D450值計(jì)算樣品中IFN-β表達(dá)量，相關(guān)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 CCK8檢測(cè)VP1對(duì)細(xì)胞的毒性影響

將不同濃度VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至24孔板HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，重懸后每個(gè)濃度4個(gè)平行轉(zhuǎn)接至96孔板，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)4 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，參考CCK8試劑說明書計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 EMCV感染HEK293細(xì)胞對(duì)Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

EMCV感染HEK293細(xì)胞12 h后，IFN-β、MDA5、MAVS、TRAF3、TBK1和IRF3 mRNA顯著上升，感染24 h時(shí)IFN-β、MDA5、MAVS、TRAF3、TBK1和IRF3 mRNA顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示上述結(jié)果差異極其顯著(圖1-A)；而通過對(duì)病毒VP1蛋白的Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病毒感染24 h能明顯檢測(cè)到VP1蛋白的表達(dá)(圖1-B)。以上結(jié)果提示，EMCV感染24 h后Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)下降可能與VP1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001.圖1 EMCV感染對(duì)Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Fig.1 Real time fluorescence quantitative PCR detected the mRNA level of type Ⅰ IFN signaling pathway related factor during EMCV infection

2.2 EMCV VP1蛋白表達(dá)驗(yàn)證及細(xì)胞活力檢測(cè)

利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1，轉(zhuǎn)染后通過IFA實(shí)驗(yàn)證明VP1蛋白在HEK293細(xì)胞中表達(dá)(圖2-A)，表明構(gòu)建的VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，通過Western-blot用HA抗體和VP1抗體證明，VP1重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞(圖2-B)和PK-15細(xì)胞(圖2-C)中特異性表達(dá)。CCK8試劑盒分析發(fā)現(xiàn)，不同劑量(0.5、1.0、1.5 μg)VP1對(duì)細(xì)胞活力無影響(圖2-D)。綜上結(jié)果表明，VP1可在細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，并且對(duì)細(xì)胞無毒性作用。

2.3 VP1蛋白對(duì)EMCV體外增殖的影響

過表達(dá)VP1細(xì)胞感染EMCV后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，VP1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制顯著高于對(duì)照組(圖3-A)。TCID50檢測(cè)也得到相似結(jié)果(圖3-B)，說明VP1可顯著促進(jìn)EMCV在HEK293細(xì)胞中的增殖。

2.4 過表達(dá)VP1對(duì)Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VP1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA，結(jié)果如圖4所示，與空載對(duì)照組相比，VP1單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞IFN-β、RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1和IRF3的mRNA水平，表明EMCV VP1可抑制細(xì)胞Ⅰ型IFN信號(hào)通路的活化。

2.5 VP1對(duì)EMCV誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN信號(hào)通路活化的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VP1對(duì)EMCV誘導(dǎo)的IFN-β與下游刺激基因的影響，結(jié)果如圖5所示。VP1轉(zhuǎn)染組經(jīng)EMCV誘導(dǎo)后，Ⅰ型IFN信號(hào)通路中相關(guān)因子MDA5、RIG-I、MAVS、TBK1、IRF3、IFN-β，以及干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)ISG15和ISG56 mRNA水平顯著低于空載EMCV感染組，表明VP1蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)可顯著抑制EMCV誘導(dǎo)Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平。

圖2 VP1在不同細(xì)胞中的表達(dá)與細(xì)胞活力檢測(cè)Fig.2 Expression of VP1 in different cell lines and cell viability detection

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和TCID50檢測(cè)EMCV病毒拷貝數(shù)和病毒感染力Fig.3 EMCV virus copy number and virus titer were detected by real time fluorescence quantitative PCR and TCID50 assay

圖4 VP1對(duì)Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA的影響Fig.4 Effect of VP1 on type Ⅰ IFN signaling pathway related factors mRNA expression

2.6 VP1對(duì)Ⅰ型IFN信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白MDA5和MAVS表達(dá)的影響

VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后Western-blot檢測(cè)Ⅰ型IFN信號(hào)通路關(guān)鍵適配器分子MDA5和關(guān)鍵接頭蛋白MAVS的表達(dá)，與空載組相比，VP1的表達(dá)可明顯減少細(xì)胞內(nèi)MAVS蛋白的表達(dá)，但對(duì)MDA5表達(dá)無明顯影響(圖6)。結(jié)果提示，VP1可能通過靶向降低MAVS蛋白表達(dá)抑制RLR信號(hào)通路，進(jìn)而通過抑制IFN-β產(chǎn)生達(dá)到促進(jìn)病毒增殖的目的。圖7是根據(jù)本研究結(jié)論推測(cè)的EMCV VP1蛋白可能通過靶向調(diào)控MAVS抑制IFN-β信號(hào)通路的模式圖，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的探討和研究。

3 討論

機(jī)體受到病原體感染時(shí)刺激細(xì)胞產(chǎn)生的IFNs是RLRs信號(hào)通路調(diào)控表達(dá)的一種重要的抗病毒因子[20]，而MAVS是RLRs信號(hào)通路中調(diào)控IFNs表達(dá)必需的接頭蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染MAVS基因敲除的小鼠時(shí)可導(dǎo)致小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞無法產(chǎn)生干擾素，使小鼠死亡率增加[21-22]。另外，大量研究表明，多種病毒通過靶向抑制MAVS表達(dá)阻止IFNs產(chǎn)生，如鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)的NS1蛋白通過與宿主MAVS蛋白的羧基端相互結(jié)合抑制IFNs信號(hào)通路的活化[23]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus， HBV)的X蛋白通過與宿主MAVS蛋白相互作用下調(diào)IFNs產(chǎn)生[24]。B型GB病毒(GB virus B，GB-B)的NS3/4A蛋白通過裂解宿主MAVS蛋白影響其正確定位而抑制IFNs產(chǎn)生[25]。

同科病毒FMDV的研究表明，RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1會(huì)阻止宿主RNA感受器的激活，也可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)作為直接的先天免疫拮抗劑拮抗宿主細(xì)胞先天免疫防御機(jī)制[26-28]。已報(bào)道EMCV的干擾素拮抗蛋白有非結(jié)構(gòu)蛋白3C、2C及先導(dǎo)蛋白L等，研究表明，EMCV 2C蛋白可作為一種新型的Ⅰ型干擾素拮抗劑，其通過與MDA5相互作用抑制先天免疫反應(yīng)，EMCV 2C蛋白的V26氨基酸在抑制IFN-β信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用[29]。EMCV的2B蛋白激活NLRP3 炎癥小體[30]。EMCV 3C蛋白干擾TANK-TBK1-IKKε-IRF3復(fù)合物，從而降低IFN-β的產(chǎn)生[31]。然而，有關(guān)EMCV結(jié)構(gòu)蛋白參與拮抗干擾素產(chǎn)生的研究尚未報(bào)道。

圖5 VP1對(duì)EMCV誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA的影響Fig.5 Effect of VP1 on EMCV induced type Ⅰ IFN signaling pathway related factors mRNA expression

圖6 Western-blot檢測(cè)VP1對(duì)MDA5和MAVS表達(dá)的影響Fig.6 Effects of VP1 on the expression of MDA5 and MAVS by Western-blot

圖7 EMCV VP1抑制IFN-β信號(hào)通路模式圖Fig.7 Pattern of EMCV VP1 suppressing IFN-β signaling pathway

本研究前期發(fā)現(xiàn)，EMCV感染HEK293細(xì)胞前期可誘導(dǎo)細(xì)胞顯著上調(diào)IFN-β與RLRs信號(hào)通路相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平，然而，在EMCV感染后期又呈顯著的抑制作用。參考FMDV病毒VP1蛋白拮抗干擾素信號(hào)通路活化的研究，發(fā)現(xiàn)EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1在EMCV誘導(dǎo)或單獨(dú)表達(dá)的情況下均能抑制IFN-β表達(dá)和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路相關(guān)因子及其下游干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這些結(jié)果表明，EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1參與IFNs拮抗作用。進(jìn)一步通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，VP1蛋白明顯抑制宿主MAVS蛋白的表達(dá)。對(duì)此研究結(jié)果我們推測(cè)，EMCV可能將宿主MAVS蛋白作為病毒逃避宿主天然免疫應(yīng)答的作用靶點(diǎn)。另外，自噬(autophagy)途徑或泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome system，UPS)是胞內(nèi)蛋白降解的主要方式[32]。結(jié)構(gòu)蛋白VP1在參與天然免疫應(yīng)答的過程中可能利用這些途徑降解了MAVS蛋白的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制RLRs信號(hào)通路活化和減少IFN-β產(chǎn)生，最終達(dá)到促進(jìn)EMCV體外增殖的目的，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討和研究。

4 結(jié)論

本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了腦心肌炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-VP1，并且實(shí)現(xiàn)了VP1蛋白與HA標(biāo)簽的融合表達(dá)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，EMCV VP1蛋白顯著抑制IFN-β及其下游效應(yīng)基因的表達(dá)，同時(shí)初步發(fā)現(xiàn) EMCV VP1蛋白通過靶向降低 MAVS蛋白表達(dá)量抑制IFN-β信號(hào)通路的活化。本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)腦心肌炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白參與機(jī)體免疫應(yīng)答，不僅豐富了腦心肌炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容，同時(shí)為抗病毒藥物的應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)和研究思路。