張興云 王 萌 潘陽(yáng)陽(yáng) 胡學(xué)權(quán) 韓金輝 余四九 徐庚全 王立斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

藏羊是中國(guó)綿羊三大品系(蒙古系、藏羊系和哈薩克綿羊系)之一[1-2]，是青藏高原牧民重要的生產(chǎn)和生活資料。但在粗放式的養(yǎng)殖模式下，受大腸桿菌(Escnerichia coli) 和 金 黃 色 葡 萄 球 菌(Staphylococcus aureus)等細(xì)菌的感染[3-6]，藏羊子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率水平較高，給當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展和人民的生活帶來(lái)了很大的影響[7]。因此研究藏羊子宮內(nèi)膜炎發(fā)病過(guò)程中相關(guān)炎性因子的表達(dá)規(guī)律，對(duì)該病的防治具有重要意義。

機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞因子可作為免疫遞質(zhì)誘導(dǎo)炎癥因子的調(diào)節(jié)并介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程[8]。白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)作為白細(xì)胞系1(interleukin-1，IL-1)的主要分泌形式，在炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其細(xì)胞因子表達(dá)水平和機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的程度相關(guān)，機(jī)體的受損程度通常由其表達(dá)量的高低反映[9-11]。白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)是炎癥早期產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，組織損傷、劇烈疼痛、應(yīng)激和炎癥的發(fā)生等均可使IL-6 的表達(dá)水平升高[12]。白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)屬于趨化因子CXC 基因家族的白細(xì)胞趨化因子[13-14]，其能趨化嗜中性粒細(xì)胞向感染部位募集，在機(jī)體抵抗炎癥中起著重要的作用[15-16]。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)由激活的單核巨噬細(xì)胞分泌，它和細(xì)胞膜上的特異性的受體結(jié)合后發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥等重要作用[17-18]。

目前治療子宮內(nèi)膜炎主要通過(guò)抗生素的治療，但大量抗生素的使用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此如何更有效地防治子宮內(nèi)膜炎已迫在眉睫。

本研究通過(guò)組織塊貼壁法和酶消化法分離培養(yǎng)藏羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometrial epithelial cells，EECs)，探索簡(jiǎn)便且高效的培養(yǎng)條件，為研究藏羊子宮內(nèi)膜生殖生理機(jī)制提供體外細(xì)胞模型；并用不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)E.coli感染后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及酶聯(lián)免疫(enyzme linked immunosorbent assay，ELISA)在基因和蛋白水平上檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α等炎性因子在藏羊EECs 上的表達(dá)，旨在為揭示子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma3110，Thermo Fisher 公司，美國(guó))；熒光倒置相差顯微鏡(CK41，Olympus，日本)；酶標(biāo)儀(I Mark，Bio-Rad，美 國(guó))；qRT-PCR 儀(Light Cycler 96，羅氏，德國(guó))。

1.2 主要試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)液(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM/F12)(12400-016)、胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)(10099-141)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、青霉素和鏈霉素(15140122)均購(gòu)自于Gibco 公司(美國(guó))；胰蛋白酶(T4799)、凍存液二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma 公司(美國(guó))；細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗體、波形蛋白(vimentin)抗體購(gòu)自Bioss 公司(北京)；標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coli(ATCC25922)來(lái)自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海晶抗)。

1.3 樣品采集與處理

空懷期健康藏羊子宮取自青海省西寧市某屠宰場(chǎng)，動(dòng)物屠宰后30 min 內(nèi)采集樣品，迅速放入含青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，4℃條件下，3 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.4 藏羊EECs 體外分離培養(yǎng)及鑒定

參考并優(yōu)化馬欣等[19]綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的純化培養(yǎng)方法，將樣品沖洗后，剪下子宮角后2/3 段，用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗3 次，剪去子宮阜，將子宮內(nèi)膜與肌肉組織分離，將子宮內(nèi)膜剪成1 mm3大小的組織塊備用。

1.4.1 組織塊貼壁法 將組織塊以2 ～3 塊·cm-2的密度接種到直徑3 cm 的培養(yǎng)皿中，每皿加入1 mL 完全培養(yǎng)基DMEM(20%FBS、50 ng·mL-1EGF)，5%CO2，37℃培養(yǎng)6 h，待組織塊貼壁后，再加入1 mL 原代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換一次培養(yǎng)基，直至細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。

1.4.2 酶消化法 將組織塊用0.2%的膠原酶Ⅰ于37℃水浴震蕩消化；待其變?yōu)楹隣顣r(shí)，輕輕吹打，將所得混懸液依次過(guò)100、200、400 目細(xì)胞篩至3 cm 培養(yǎng)皿中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，分別置于添加50 ng·mL-1EGF 和未添加EGF 的完全培養(yǎng)基DMEM(20%FBS)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.3 細(xì)胞的純化及傳代 將上皮細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶[含乙二胺四乙酸(thylene amine ttraacetic cid，EDTA)]，37℃消化0.5～1 min，棄去纖維細(xì)胞，再加入1 mL 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)，37℃消化2～3 min，鏡下觀察大部分梭形細(xì)胞變圓漂浮，此時(shí)加完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.4 細(xì)胞鑒定 采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)波形蛋白和角蛋白-18 在待測(cè)細(xì)胞上的表達(dá)，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×104個(gè)·mL-1接種于24 孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 ～3 遍；每孔加1 mL 4%多聚甲醛，固定30 min；PBS 振蕩清洗，每孔加250 μL 0.5%TritonX-100，通透20 min；PBS 振蕩清洗，每孔加入250 μL 封閉液1 h，棄廢液，每孔加250 μL 已稀釋(1 ∶100)的一抗，4℃孵育樣品過(guò)夜；回收一抗，用PBS 振蕩清洗，每孔加250 μL 已稀釋(1 ∶400)的二抗(山羊抗兔IgG)，37℃避光孵育1 h；PBS 振蕩清洗，每孔加250 μL 4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)染核，避光孵育3 min，PBS 清洗后用熒光顯微鏡觀察。免疫熒光方法鑒定細(xì)胞時(shí)，試驗(yàn)組一抗為波形蛋白、角蛋白-18，陰性對(duì)照組為PBS。

1.4.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將細(xì)胞密度調(diào)整至5×103個(gè)·mL-1接種到24 孔板，5%CO2、37℃培養(yǎng)，每2 d 換一次培養(yǎng)液；以接種細(xì)胞開始記為0 d，每隔24 h 取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)并取平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d；以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以單位(mL)細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4.6 細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇 細(xì)胞凍存時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度并根據(jù)所需加入凍存液，轉(zhuǎn)入凍存管并封口。先將凍存管放在4℃冰箱30 min，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱放置20 min，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱過(guò)夜。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，取出凍存細(xì)胞并訊速置于37℃恒溫水浴鍋中，加3 ～5 mL 15%FBS 培養(yǎng)液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，調(diào)整密度后，5%CO2、37℃培養(yǎng)。

1.5 E.coli 培養(yǎng)及細(xì)胞感染試驗(yàn)

1.5.1E.coli的培養(yǎng)E.coli采用劃線法接種至固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h；待菌株形成單個(gè)菌落，挑取單個(gè)菌落接種至1 mL LB(luria-bertani)液體培養(yǎng)基，置于恒溫振蕩器，37℃震蕩培養(yǎng)24 h，得到菌懸液；通過(guò)活菌計(jì)數(shù)法對(duì)其計(jì)數(shù)后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2E.coli感染試驗(yàn) 將細(xì)胞調(diào)整密度后接種在6 孔板，5%CO2、37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PBS 清洗后取3 孔計(jì)數(shù)并取平均值；設(shè)置不同的MOI 進(jìn)行E.coli感染試驗(yàn)，即設(shè)空白對(duì)照(正常培養(yǎng)的細(xì)胞，CK)、1 ∶1、5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1、50 ∶1共6 組試驗(yàn)?zāi)Ｐ?MOI 為細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù))，每孔各加2 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并按所設(shè)MOI加入相應(yīng)體積E.coli；37℃感染培養(yǎng)3 h，觀察并拍照。

1.6 細(xì)胞總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

提取感染細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；反應(yīng)體系(20 μL):6 μL ddH2O，2 μL 5×gDNA digester Buffer，1 μL gDNA digester，1 μL 模板RNA，42℃孵育2 min，再加10 μL 2×Honor? ⅡSuperMix plus。反應(yīng)條件:25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存。

1.7 引物設(shè)計(jì)

在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索羊IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和β-actin基因序列，用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工基因公司合成，引物序列見表1。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the test

1.8 qRT-PCR 檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的基因表達(dá)

通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的基因表達(dá)，β-actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系(20 μL):TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，cDNA 模板2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)4 個(gè)重復(fù)組，試驗(yàn)重復(fù)3次。通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算上述基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 25 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.9 ELISA 檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的蛋白表達(dá)

E.coli感染藏羊EECs 3 h 后將6 孔板上清液保存至1.5 mL 無(wú)菌離心管中，并通過(guò)ELISA 測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定

2.1.1 組織塊貼壁法 組織塊培養(yǎng)到第7 天時(shí)周圍已有細(xì)胞長(zhǎng)出，主要有2 種細(xì)胞，分別是纖維細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞(圖1-A)；再經(jīng)過(guò)1 ～2 d 的培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸融合在一起，單層鋪滿組織周圍(圖1-B)，此時(shí)PBS清洗后可將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行純化，去除大部分纖維細(xì)胞以及部分上皮樣組織塊；繼續(xù)培養(yǎng)1 ～2 d 后細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)皿面積的80%以上(圖1-C)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況重復(fù)純化過(guò)程，可將纖維細(xì)胞及上皮樣組織塊逐步去除干凈，可得到純度較高的藏羊EECs(圖1-D)。

2.1.2 酶消化法 經(jīng)過(guò)12 h 培養(yǎng)后無(wú)EGF 組上皮樣細(xì)胞貼壁較少，而EGF 組上皮樣細(xì)胞已大量貼壁，兩組上皮樣細(xì)胞均簇?fù)碓谝黄?圖2-A、圖3-A)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)少量成纖維細(xì)胞；此時(shí)給兩組細(xì)胞更換培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，細(xì)胞即可鋪滿培養(yǎng)瓶底部(圖2-B、圖3-B)，但EGF 組細(xì)胞明顯更密集；PBS 清洗后可將兩組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶利用差速消化法進(jìn)行純化，此時(shí)將完全培養(yǎng)基濃度由20%FBS 降至15%FBS，其余條件不變，培養(yǎng)48 h 后(第2 代)，無(wú)EGF 組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則較亂(圖2-C)，而EGF 組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則且長(zhǎng)勢(shì)良好(圖3-C)；根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況重復(fù)兩組細(xì)胞純化培養(yǎng)過(guò)程，可將EGF 組成纖維細(xì)胞逐步去除干凈，得到純度較高的藏羊EECs(圖3-D、E)，并可傳至6 代以上(圖3-G)，無(wú)EGF 組細(xì)胞則從第3 代開始細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)及活性快速下降，純度也開始降低，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞量減少(圖2-D)。

2.1.3 EECs 的鑒定 細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)顯示，PBS(陰性對(duì)照)、波形蛋白在上皮細(xì)胞質(zhì)上不表達(dá)，呈陰性(圖4-A2、A3、B2、B3)，角蛋白-18 在上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，呈陽(yáng)性(圖4-C2)，鑒定顯示，僅有極少成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，藏羊EECs 純度達(dá)98%以上。

圖1 組織塊貼壁法獲得的藏羊EECsFig.1 Tibetan sheep EECs cultured by tissue explants adherent method

圖2 酶消化法獲得的藏羊EECs(無(wú)EGF)Fig.2 Tibetan sheep EECs cultured by enzymatic digestion (without EGF)

圖3 酶消化法獲得的藏羊EECs(含EGF)Fig.3 Tibetan sheep EECs cultured by enzymatic digestion (with EGF)

2.1.4 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 接種細(xì)胞后，第1 天時(shí)細(xì)胞微量增殖，速度較慢，處于停滯期；第2 天時(shí)，細(xì)胞增殖較明顯；第3 天開始細(xì)胞增殖極為旺盛，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；第5 天時(shí)，細(xì)胞增殖達(dá)到最高值，細(xì)胞不再增殖，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。根據(jù)所得曲線，藏羊EECs 的生長(zhǎng)曲線似“S”形(圖5)。

2.2 E.coli 感染藏羊EECs

經(jīng)活菌計(jì)數(shù)測(cè)得E.coli濃度為7×108CFU·mL-1，細(xì)胞計(jì)數(shù)法得到6 孔板單孔平均細(xì)胞數(shù)為3.6×105個(gè)；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白組細(xì)胞狀態(tài)良好；當(dāng)MOI 為1 ∶1時(shí)，僅有少量E.coli附著在細(xì)胞表面，出現(xiàn)空泡樣，細(xì)胞正常生長(zhǎng)(圖6-A、B)；當(dāng)MOI 為5 ∶1和10 ∶1時(shí)，細(xì)胞開始脫落且能明顯看到E.coli附著在細(xì)胞表面，此時(shí)大部分細(xì)胞也可正常生長(zhǎng)(圖6-C、D)；當(dāng)MOI 為20 ∶1和50 ∶1時(shí)，細(xì)胞上附著有大量E.coli，并出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，只有少量細(xì)胞能正常生長(zhǎng)(圖6-E、F)。

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的基因表達(dá)情況

由圖7、8 可知，E.coli感染藏羊EECs 3 h 后，與CK 相比，當(dāng)MOI 為1 ∶1時(shí)，IL-1β、IL-6 和IL-8 基因的相對(duì)表達(dá)量升高，但不顯著，TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高且差異顯著；隨著MOI 增加，除TNF-α基因外，其余各基因的相對(duì)表達(dá)量均逐漸增加，當(dāng)MOI為20 ∶1時(shí)，IL-8 基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高；當(dāng)MOI為50 ∶1時(shí)，IL-1β、IL-6 基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，而TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量較CK 升高不顯著。

圖4 藏羊EECs 免疫熒光鑒定Fig.4 Immunofluorescence identification of Tibetan sheep EECs

圖5 藏羊EECs 生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of Tibetan sheep EECs

2.4 ELISA 檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的蛋白表達(dá)情況

由圖9、10 可知，IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α在蛋白合成過(guò)程中與其基因的相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)一致，即E.coli感染藏羊EECs 3 h 后，當(dāng)MOI 為1 ∶1 時(shí)，IL-1β、IL-6 和IL-8 的蛋白含量與CK 相比較變化不明顯，但TNF-α的蛋白含量達(dá)到最高；隨著MOI 增加，除TNF-α外，其余各基因的蛋白含量逐步增加，當(dāng)MOI 為20 ∶1時(shí)，IL-8 的蛋白含量達(dá)到最高；當(dāng)MOI 為50 ∶1時(shí)，IL-1β、IL-6 的蛋白含量達(dá)到最高，而TNF-α基因的蛋白含量變化不顯著。

3 討論

3.1 藏羊EECs 體外分離培養(yǎng)

圖6 不同MOI 下藏羊EECs 的形態(tài)變化Fig.6 Morphological changes of Tibetan sheep EECs at different MOI

圖7 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-1β、IL-6 基因的相對(duì)表達(dá)Fig.7 Relative expression of IL-1β and IL-6 gene in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

圖8 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-8、TNF-α 基因的相對(duì)表達(dá)Fig.8 Relative dxpression of IL-8 and TNF-α gene in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

圖9 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-1β、IL-6 的蛋白表達(dá)Fig.9 Protein expression of IL-1β and IL-6 in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

圖10 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-8、TNF-α 的蛋白表達(dá)Fig.10 Protein expression of IL-8 and TNF-α in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

研究表明，EGF 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響具有物種差異性和劑量依賴性[20-23]，低劑量EGF 可促進(jìn)增殖，而高劑量EGF 可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡[24]。本試驗(yàn)通過(guò)組織塊貼壁及酶消化2 種方法對(duì)藏羊EECs 進(jìn)行體外培養(yǎng)，并在酶消化法培養(yǎng)過(guò)程中設(shè)置了加入低劑量(50 ng·mL-1)的EGF 組和無(wú)EGF 組。何志全等[25]、陳利平等[26]在組織塊貼壁法培養(yǎng)過(guò)程中用刀刮取子宮內(nèi)膜上皮組織使其呈糊狀后再進(jìn)行培養(yǎng)，但是用刀刮取過(guò)程對(duì)上皮組織造成巨大損傷，致使細(xì)胞活力降低且不易存活。趙誠(chéng)悅等[27]發(fā)現(xiàn)組織塊貼壁法獲得的細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，但無(wú)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。馬欣等[19]成功通過(guò)組織塊貼壁法獲得較高純度的綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，但此方法獲得的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)5～7 次的純化，該細(xì)胞在經(jīng)過(guò)3～4 次傳代后細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變化，如體積變大、內(nèi)部出現(xiàn)空泡，活性降低，表現(xiàn)為不易消化、貼壁情況不佳以及生長(zhǎng)緩慢等。本試驗(yàn)采用改良的組織塊培養(yǎng)法，在培養(yǎng)液中加入50 ng·mL-1EGF，可顯著促進(jìn)上皮細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行2 ～3 次消化去除基質(zhì)細(xì)胞可得到較高純度的EECs，從第4 代細(xì)胞開始細(xì)胞體積變大，活性逐漸下降，這可能與胰蛋白酶的長(zhǎng)時(shí)間作用有關(guān)。王偉[28]用0.25%膠原酶Ⅰ在37℃水浴消化奶牛子宮上皮組織3 ～4 h，得到純度98%的EECs；馬欣等[19]用0.1%膠原酶Ⅰ在37℃消化綿羊子宮上皮組織6 h，得到純度70%的EECs。本試驗(yàn)采用0.2%膠原酶Ⅰ37℃震蕩水浴消化6 h，依次過(guò)100、200、400 目細(xì)胞篩后可得到所需的EECs；同時(shí)用完全培養(yǎng)基反沖400 目細(xì)胞過(guò)濾篩后可得到純度較高的EECs。為驗(yàn)證不同條件下上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，本試驗(yàn)設(shè)置了無(wú)EGF 組和EGF 組，從原代細(xì)胞開始，EGF 組表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶利用差速消化法進(jìn)行純化，只需30 s 即可去除成纖維細(xì)胞、90 ～120 s 可使所有細(xì)胞變圓漂浮，培養(yǎng)時(shí)貼壁情況也較好，可在3～4 次將成纖維細(xì)胞以及其他雜細(xì)胞快速去除干凈，經(jīng)鑒定可獲得純度98%以上的EECs；而無(wú)EGF 組細(xì)胞則從第3 代開始細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)及活性快速下降，純度也開始降低，細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞量逐步減少。EGF 組獲得的細(xì)胞可傳至6 代以上，可用于后續(xù)試驗(yàn)，這也為構(gòu)建藏羊子宮內(nèi)膜體外模型奠定了基礎(chǔ)。

3.2 IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生子宮內(nèi)膜炎時(shí)，病原微生物入侵子宮腔，對(duì)子宮內(nèi)膜的上皮屏障造成破壞，子宮內(nèi)膜的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)變化，同時(shí)能夠引起子宮組織對(duì)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的變化[29]。IL-1β[10]、IL-6[12，30]、IL-8[15，31-33]、TNF-α[20]等作為炎性因子，在炎癥反應(yīng)中有著極其重要的作用，炎性因子表達(dá)水平的升高或降低與機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的程度存在相互協(xié)同的關(guān)系，其表達(dá)量的高低決定了機(jī)體受損的程度。Loyi 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，患子宮內(nèi)膜炎的奶牛子宮組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)集體上調(diào)。Ghasemi 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在確診為子宮內(nèi)膜炎的奶牛子宮組織中IL-6 的表達(dá)上調(diào)約30 倍，TNF-α的表達(dá)上調(diào)約20 倍。王偉[28]在體外通過(guò)不同濃度E.coli以及S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞并建立奶牛子宮內(nèi)膜炎病理模型后發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 的表達(dá)量也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。鄭強(qiáng)強(qiáng)[29]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊子宮內(nèi)注入E.coli后，TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)量迅速上升，且對(duì)山羊子宮形成急性感染。在本試驗(yàn)中，經(jīng)E.coli感染藏羊EECs 3 h 后，也能成功建立體外子宮內(nèi)膜炎病例模型，隨著MOI 的逐漸增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐步遭到破壞，直至細(xì)胞大量死亡脫落。IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α基因的mRNA 表達(dá)量與蛋白的表達(dá)量趨勢(shì)基本一致，與上述研究結(jié)果相似，但當(dāng)MOI 為1 ∶1時(shí)，TNF-α表達(dá)量顯著提高，而MOI 為50 ∶1時(shí)卻提高不顯著，與其他因子的表達(dá)量不一致，有待進(jìn)一步研究。接種E.coli不僅能夠引起藏羊EECs 的局部感染以及形態(tài)變化，同時(shí)也能夠引起藏羊EECs 對(duì)炎癥細(xì)胞因子在基因和蛋白水平上表達(dá)的變化。因此，上述各炎癥因子可作為識(shí)別藏羊子宮內(nèi)膜炎病理程度的重要指標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中加入50 ng·mL-1EGF 后成功用組織塊貼壁法及酶消化法分離培養(yǎng)出藏羊EECs，且只有添加EGF 的酶消化法培養(yǎng)的藏羊EECs可正常傳代，通過(guò)波形蛋白及角蛋白-18 免疫熒光鑒定，藏羊EECs 純度達(dá)到98%以上，這為研究藏羊子宮內(nèi)膜生殖生理機(jī)制提供了體外細(xì)胞模型。不同MOIE.coli感染下藏羊EECs 結(jié)構(gòu)逐漸遭到破壞，MOI 越大，細(xì)胞壞死越嚴(yán)重。同時(shí)IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α基因和蛋白表達(dá)量均較空白對(duì)照組明顯升高。本研究結(jié)果為識(shí)別藏羊子宮內(nèi)膜炎病理程度提供了參考指標(biāo)。