陳嘉琪，王革生，周玉嘉，劉佳霖，宋光榮，裴珍珍，鄭 粲

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非顱腦外傷引起的原發(fā)性腦實(shí)質(zhì)出血，是具有高致殘率、高死亡率疾病[1]。研究顯示，ICH每年發(fā)病率為(60～80)/10 萬(wàn)，占卒中的20%，致死病例數(shù)接近全世界所有卒中死亡病例的1/2，ICH急性期病死率約30%～40%[2]，近年ICH發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。目前腦出血西醫(yī)治療以?xún)?nèi)科保守常規(guī)治療與外科手術(shù)治療為主。中醫(yī)針對(duì)ICH具有豐富的臨證經(jīng)驗(yàn)，關(guān)于提高存活率，降低致殘率、病死率，提高預(yù)后生存質(zhì)量的ICH中醫(yī)藥研究意義重大。

ICH屬中醫(yī) “中風(fēng)”范疇，病因可分為內(nèi)風(fēng)、火熱、痰濁、血瘀、毒邪等，其病因中血瘀與ICH發(fā)病關(guān)系密切[3]，故中醫(yī)治療重視活血化瘀法[4]。因ICH急性期的出血性質(zhì)，故亦屬于中醫(yī)“血證”范疇。《血證論》中曰：“既是離經(jīng)之血，雖是清血鮮血，亦是瘀血”、“瘀血不去，則出血不止，新血不生”，瘀血蓄積顱內(nèi)，是ICH的病理基礎(chǔ)，又轉(zhuǎn)化為腦出血的病理產(chǎn)物；另外中醫(yī)病機(jī)認(rèn)為“瘀血生風(fēng)”[5]，“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”，故活血化瘀為ICH急性期治療的關(guān)鍵,ICH 患者采用活血化瘀療法可促進(jìn)血腫的吸收,改善預(yù)后[6]。牡丹皮與赤芍為中風(fēng)病常用藥，為臨床上活血化瘀常用藥對(duì)，在當(dāng)歸散、羚羊角散等方中出現(xiàn)。明代《滇南本草》中記載，赤芍性苦、涼，能破瘀血，散血塊；牡丹皮味酸、辛，性寒，能破血、行血，除血分之熱。目前赤芍-牡丹皮配伍治療ICH的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路仍不清楚，有待研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物系統(tǒng)與藥理學(xué)為知識(shí)框架，能結(jié)合多個(gè)靶點(diǎn)、生物過(guò)程、信號(hào)通路等系統(tǒng)分析探討藥物間協(xié)同作用[7]，為運(yùn)用于中醫(yī)整體觀念指導(dǎo)下的中藥配對(duì)應(yīng)用研究提供作用。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘赤芍-牡丹皮配伍對(duì)ICH干預(yù)與影響的相關(guān)成分與靶點(diǎn)，從整體探討藥物對(duì)ICH的調(diào)控作用，探索ICH治療的新作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路，為后續(xù)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

本研究主要使用的數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件：中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/)、Genecards數(shù)據(jù)(https://www.genecards.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)、UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)、STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.bioconductor.org/)、Cytoscape3.7.2軟件、R語(yǔ)言。

1.2 赤芍-牡丹皮配伍活性成分整理篩選與ICH靶點(diǎn)的挖掘

分別以“赤芍”、“牡丹皮”為關(guān)鍵詞在TCMSP中進(jìn)行檢索，收集成分并獲取每個(gè)成分編號(hào)，依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的生物口服利用度(oral bioavailability，OB)、類(lèi)藥性(drug-likeness，DL)值，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為候選活性成分的依據(jù)，從中篩選出中藥活性成分及對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)信息，并利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將獲得的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。利用關(guān)鍵詞“Intracerebral hemorrhage”在OMIM、Genecards、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得ICH疾病靶點(diǎn)的信息,與赤芍-牡丹皮的活性成分比對(duì)后獲得交集靶點(diǎn)，繪制“赤芍-牡丹皮”的活性成分靶點(diǎn)和ICH靶點(diǎn)的韋恩圖。

1.3 核心靶點(diǎn)篩選與“活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將獲得ICH疾病靶點(diǎn)的信息,與赤芍-牡丹皮的活性成分比對(duì)后獲得交集靶點(diǎn)，繪制中藥活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的韋恩圖。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-重要活性成分-疾病靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)圖，中藥成分或靶點(diǎn)表示為網(wǎng)絡(luò)之中的節(jié)點(diǎn)，他們之間的聯(lián)系表示為邊，節(jié)點(diǎn)直接連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)目。

1.4 “赤芍-牡丹皮”治療ICH 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)基因上傳至在線(xiàn)STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)設(shè)置蛋白質(zhì)種類(lèi)為“homo sapiens(人類(lèi)) ”，作用閾值設(shè)置為“medium confidence(中等) ”，其它條件設(shè)置默認(rèn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。獲取相應(yīng)的蛋白相互作用信息，根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的Count值大小篩選重要靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

獲取核心靶點(diǎn)后，利用R語(yǔ)言和Bioconductor數(shù)據(jù)包進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析，GO富集依據(jù)分子功能( molecular function，MF) ，生物學(xué)過(guò)程( biological process，BP) 及細(xì)胞組分( cellular component，CC)進(jìn)行。根據(jù)獲得的“赤芍-牡丹皮”與ICH疾病共有的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行功能注釋和富集分析結(jié)果，探討其治療ICH的重要生物學(xué)過(guò)程及相關(guān)信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

收集得赤芍主要化學(xué)成分119個(gè)、牡丹皮55個(gè)。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選后獲得38個(gè)活性成分，其中赤芍27個(gè)，牡丹皮9個(gè)，共同成分2個(gè)，包括芍藥苷、黃芩素、β-谷固醇、谷甾醇等。見(jiàn)表1。

表1 赤芍-牡丹皮主要有效活性成分Tab 1 The main active ingredients of “Chishao-Mudanpi”

2.2 赤芍-牡丹皮與ICH共同靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

通過(guò)檢索Genecards、OMIM 、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到ICH相關(guān)的基因靶點(diǎn)共823個(gè)，去除重復(fù)后得778個(gè)；赤芍-牡丹皮配伍共同潛在靶點(diǎn)116個(gè)；二者交集獲得赤芍-牡丹皮配伍與ICH疾病共有靶點(diǎn)72個(gè)，繪制相應(yīng)的韋恩圖，見(jiàn)圖1。構(gòu)建的“赤芍-牡丹皮-重要活性成分-ICH疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中共含節(jié)點(diǎn)89個(gè)，邊線(xiàn)356條，顯示ICH可對(duì)應(yīng)不同靶點(diǎn)，不同靶點(diǎn)可對(duì)應(yīng)赤芍-牡丹皮配伍的不同潛在活性成分，可見(jiàn)赤芍-牡丹皮配伍治療ICH作用機(jī)制具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖1 赤芍-牡丹皮和ICH疾病的靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig 1 Wayne diagram of "Chishao-Mudanpi" and ICH disease target

紅色圓點(diǎn)表示“赤芍-牡丹皮”配伍，黃色圓點(diǎn)表示中藥配伍有效成分，綠色圓點(diǎn)表示腦出血，藍(lán)色圓點(diǎn)表示作用靶點(diǎn)，灰色線(xiàn)條表示其中相互作用關(guān)系。圖2 赤芍-牡丹皮-重要活性成分-ICH疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 The active components of “Chishao-Mudanpi” with ICH disease-target interaction network

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將72個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)，得到TSV文本后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。根據(jù)Count值大小篩選出前30位的靶點(diǎn)，其中前10位分別為是AKT1(Count 62)、IL-6(Count 57)、VEGFA(Count 55)、CASP3(Count 52)、EGF(Count 51)、MAPK8(Count 51)、MMP9(Count 51)、PTGST2(Count 51)、JUN(Count 50)、IL-1B(Count 49)，見(jiàn)圖4。

圖3 “赤芍-牡丹皮”治療ICH靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig 3 “Chishao-Mudanpi” therapeutic ICH target protein interaction network

圖4 “赤芍-牡丹皮”治療ICH PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因(排名前30)Fig 4 Core gene of “Chishao-Mudanpi” PPI network for ICH treatment(top 30)

2.4 GO富集分析與KEGG通路分析

GO富集分析分為BP、MF、CC 3個(gè)部分(圖5～7顯示各部分富集前20結(jié)果)，其中BP涉及條目主要集中在脂多糖、金屬離子、活性氧等相關(guān)反應(yīng)等，MF集中細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等,CC集中膜筏、膜微區(qū)、囊腔等功能位置，推測(cè)赤芍-牡丹皮主通過(guò)以上途徑對(duì)ICH治療起作用。KEGG富集獲133條相關(guān)通路，篩選出20條具有顯著意義的富集通路，其中AGE-RAGE、TNF、IL-17、HIF1、PI3K-Akt與ICH關(guān)系密切等，見(jiàn)表2。

圖5 赤芍-牡丹皮潛在靶標(biāo)GO通路富集分析(BP模塊)Fig 5 GO pathway enrichment analysis for biological process of candidate targets of active components of “Chishao-Mudanpi”

圖6 赤芍-牡丹皮潛在靶標(biāo)GO通路富集分析(CC模塊)Fig 6 GO pathway enrichment analysis for cellular component of candidate targets of active components of “Chishao-Mudanpi”

圖7 赤芍-牡丹皮潛在靶標(biāo)GO通路富集分析(MF模塊)Fig 7 GO pathway enrichment analysis for molecular function of candidate targets of active components of “Chishao-Mudanpi”

表2 赤芍-牡丹皮活性成分潛在靶標(biāo)KEGG通路富集分析Tab 2 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active components of “Chishao-Mudanpi”

3 討論

ICH損害的病理過(guò)程復(fù)雜，主要是發(fā)病后腦組織血腫周?chē)嬖谒[，引起凝血酶激活、炎癥反應(yīng)、紅細(xì)胞溶解[8]，繼而細(xì)胞凋亡、炎癥、神經(jīng)細(xì)胞壞死等導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙[9-12 ]，ICH治療有針對(duì)改善上述病理過(guò)程的意義。赤芍與牡丹皮均為清熱涼血藥，臨床常相須為用，協(xié)同增涼血、活血的有效成分作用[13-14]。赤芍主要藥理作用是減低血液黏稠度、抑制血小板凝聚、舒張血管、改善微循環(huán)[15]，牡丹皮具有較強(qiáng)的抑菌抗炎、抗腫瘤、降糖、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)及保護(hù)血管等多種作用[16]。本研究結(jié)果中，赤芍-牡丹皮配伍的重要成分共有38個(gè)，赤芍27個(gè)，牡丹皮9個(gè)，二者具有2個(gè)重疊成分。赤芍-牡丹皮配伍的重要成分的抗炎、抗凝、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用在ICH治療中不容忽視實(shí)驗(yàn)證明，赤芍中含有的黃芩素能保護(hù)腦內(nèi)皮細(xì)胞抗缺氧及過(guò)氧化氫影響，具有抗凋亡、刺激神經(jīng)發(fā)生和促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)等多種藥理活性[17]；而赤芍、牡丹皮中共有的植物甾醇成分如豆留醇、β-谷甾醇具有抗炎活性[18]。

赤芍與牡丹皮中有效成分的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)表明，AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、EGF等是赤芍-牡丹皮治療ICH的前5個(gè)最重要關(guān)鍵靶點(diǎn)。蛋白激酶B(Akt)是PI3K下游主要信號(hào)分子,也是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的靶激酶[19]，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及抗凋亡起重要作用，有研究表明誘導(dǎo)Akt1表達(dá)可使ICH小鼠腦神經(jīng)保護(hù)和功能方面獲得改善[20]。半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)調(diào)控凋亡過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)，通過(guò)激活CASP3以進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡[21]。實(shí)驗(yàn)證明caspases-3表達(dá)上升，能反映ICH腦實(shí)質(zhì)的損害程度,表明細(xì)胞凋亡參與了ICH繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷,caspase-3表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用[22]。白細(xì)胞介素6(IL-6)是炎性細(xì)胞因子之一，研究顯示IL-6與ICH存在關(guān)聯(lián)[23]，增強(qiáng)IL-6表達(dá)可抗炎癥反應(yīng)與神經(jīng)元損傷,從而減輕出血周?chē)M織壞死，促進(jìn)血腫吸收及神經(jīng)修復(fù)[24]。內(nèi)皮生成因子(VEGFA) 能穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞完整性，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生成[25]。促進(jìn)VEGF的表達(dá)，增強(qiáng)微血管的抗損傷能力從而降低微血管損失程度；并通過(guò)重構(gòu)微血管系統(tǒng)起血管修復(fù)作用，促進(jìn)氧和代謝物交換，清除壞死物，有利于神經(jīng)功能恢復(fù)[26]。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及其受體與炎癥反應(yīng)、活性氧生成、髓鞘脫失和神經(jīng)元修復(fù)過(guò)程相關(guān)[27]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)中發(fā)揮協(xié)同作用。

GO與KEGG 富集分析結(jié)果表明，赤芍-牡丹皮治療ICH涉及多方面生物學(xué)過(guò)程和多條重要信號(hào)通路參與。而與ICH相關(guān)性高的AGE-RAGE、TNF、IL-17、HIF1、PI3K-Akt信號(hào)通路，主要在血管內(nèi)皮保護(hù)、炎癥機(jī)制調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡機(jī)制等方面發(fā)揮調(diào)控作用。

AGEs-RAGE與細(xì)胞凋亡相關(guān)。在內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表面有受體RAGE，可以與AGEs結(jié)合形成AGE-RAGE，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列氧化等反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)阻斷AGEs-RAGE 信號(hào)途徑能減少細(xì)胞的凋亡[28]，通過(guò)阻斷AGEs-RAGE的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),減少氧化應(yīng)激反應(yīng)所致的靶器官損害[29]。推測(cè)赤芍-牡丹皮作用于此通路，減輕ICH造成的神經(jīng)損害，保護(hù)神經(jīng)元。

TNF與PI3K-Akt是凋亡相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路。ICH患者神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)呈一致性[30]，而赤芍-牡丹皮含有的β-谷甾醇可通過(guò)抑制TNF相關(guān)信號(hào)通路作用于炎癥過(guò)程和免疫抑制[31]。Akt蛋白通過(guò)激活PI3K信號(hào)傳導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用。研究示r-OPN 能夠通過(guò) PI3K-Akt-GSK-3β信號(hào)通路改善了海馬CA1 區(qū)的突觸可塑性，最終對(duì) ICH 大鼠認(rèn)知記憶功能保護(hù)的作用[32]。

IL-17是廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子之一，參與體內(nèi)大量的炎性反應(yīng)，研究顯示ICH患者血腫周?chē)M織的IL-17表達(dá)上調(diào)和活性增強(qiáng)，從而加重炎性反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞損傷，造成病情惡化[33]。

HIF1通路與氧化作用相關(guān)，HIF-1α是機(jī)體細(xì)胞在缺氧的微環(huán)境下發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，在低氧微環(huán)境中其活性提高，參與調(diào)控多種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，使機(jī)體細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)。研究顯示ICH患者形成的腦水腫可使周?chē)M織處于缺氧狀態(tài)，從而血清HIF-1α水平明顯升高[34]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從整體的角度對(duì)赤芍-牡丹皮配伍治療ICH的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)赤芍-牡丹皮中芍藥苷、黃芩素、β-谷固醇等成分直接作用AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、EGF等相關(guān)靶點(diǎn)起作用，并可能通過(guò)AGEs-RAGE、TNF、IL-17、PI3K-Akt等信號(hào)通路抑制凋亡與炎癥，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，及刺激HIF1通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮修復(fù)，抑制ICH病理發(fā)展過(guò)程，體現(xiàn)中醫(yī)藥治療疾病多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。同時(shí)，本研究分析的赤芍-牡丹皮治療ICH的分子機(jī)制，為深入研究赤芍-牡丹皮治療ICH的作用機(jī)制提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。