漆國棟，江瓊，伍亞民，申開琴，楊琴，漆偉

1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院骨科，重慶市 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市 400016；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶市400042

脊髓損傷致殘率高，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前臨床康復(fù)采用多學(xué)科協(xié)同方案，但效果有限[1]。種子細胞與生物支架構(gòu)建的脊髓組織工程可能成為未來脊髓損傷康復(fù)的關(guān)鍵方向，現(xiàn)階段重點為選擇不同種類細胞與支架，探索最適宜的構(gòu)建方案[2-3]。神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)源于神經(jīng)組織，作為種子細胞中最能定向分化為神經(jīng)譜系的細胞，可直接代替損傷的神經(jīng)樣細胞，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，改善損傷處微環(huán)境，但存在單獨應(yīng)用時存活率較低、分化不可控等缺點[4-6]。脊髓脫細胞支架(spinal cord acellular scaffold,SCAS)為正常脊髓組織經(jīng)脫除細胞后保留的細胞外基質(zhì)，成分和結(jié)構(gòu)與正常脊髓高度相似，具有低免疫原性和良好的生物相容性[7]。將骨髓間充質(zhì)干細胞種植于SCAS，發(fā)現(xiàn)該細胞與支架復(fù)合良好，可生存、生長并分化為神經(jīng)譜系細胞[8-9]。本課題組前期對體外培養(yǎng)的NSCs增殖與分化調(diào)控進行探索[10-12]，結(jié)合相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)NSCs 具備復(fù)合生物支架構(gòu)建脊髓組織工程的可行性[13]。本研究選擇NSCs 作為種子細胞，與SCAS 進行脊髓組織工程構(gòu)建，初步探討該模式的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑與儀器

SPF 級 新 生24 h Sprague-Dawley 大 鼠、SPF 級Sprague-Dawley 雌性大鼠，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012-0001。所有操作均依據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細則》要求，符合動物福利與倫理原則。

Neural basal 培養(yǎng)基、B-27、Acctuase 酶、胎牛血清：美國GIBCO 公司。堿性纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)：美國PEPROTECH 公司。小鼠單克隆抗Nestin 抗體：美國MILLIPORE 公司。兔多克隆抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體：美國INVITROGEN公司。小鼠單克隆抗微管相關(guān)蛋白-2 (microtubule associated protein-2,MAP-2)抗體：英國ABCAM 公司。DMEM/F12 培養(yǎng)基、0.25%胰酶：美國HYCLONE 公司；DyLight488標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、TRITC 標(biāo)記山羊抗兔二抗、DAPI、HE 染色試劑盒、免疫組化染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。TritonX-100、脫氧膽酸鈉、PBS、正常山羊血清：北京索萊寶科技有限公司。激光共聚焦顯微鏡、冰凍切片機：德國LEICA 公司。熒光倒置顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。冷凍干燥機、細胞培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱：美國THERMO FISHER SCIENTIFIC公司。掃描式電子顯微鏡：日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCs

1.2.1.1 原代培養(yǎng)及傳代

新生24 h 內(nèi)大鼠5 只，斷頭取腦。無菌條件下仔細剝離腦膜和血管，眼科鑷前緣解剖分離大腦皮質(zhì)，鋒利剪刀剪成1 mm3小塊。加適量0.25%胰酶，37 ℃消化15～20 min；胎牛血清終止消化，藍槍頭均勻用力吹打10～15 次，200 目細胞篩過濾，形成單細胞懸液。離心，棄上清液，加適量培養(yǎng)基吹打、重懸。重復(fù)離心、重懸步驟。細胞計數(shù)，以1×106/ml 接種于6 cm培養(yǎng)皿中，增殖培養(yǎng)基含DMEM/F12、2%B-27、20 ng/ml EGF 和20 ng/ml bFGF，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d 半量換液1 次，6～7 d 傳代1 次。傳代時，細胞懸液離心，棄上清液，Acctuase 酶吹打、重懸，37 ℃消化10 min；離心，去Acctuase 酶，加培養(yǎng)基，均勻用力吹打30～50 次，加入適量增殖培養(yǎng)基重懸。傳代后培養(yǎng)方式同原代。

1.2.1.2 鑒定

1.2.1.2.1 Nestin鑒定

取第3 代神經(jīng)球，接種于多聚賴氨酸包被的六孔板無菌爬片中培養(yǎng)4 h 貼壁。4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。加Nestin 一抗(1∶200) 4 ℃孵育過夜。加Dylight488 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h。DAPI 染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.1.2.2 分化鑒定

取第3 代神經(jīng)球吹散后，接種于多聚賴氨酸包被后的六孔板無菌爬片中分化培養(yǎng)7 d，分化培養(yǎng)基含Neural basal、2%B-27和10%胎牛血清。4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。加Map-2 (1∶500)、GFAP(1∶1000)一抗4 ℃孵育過夜。加Dylight488 標(biāo)記山羊抗小鼠(1∶100)、TRITC標(biāo)記山羊抗兔(1∶100)二抗37 ℃孵育1 h。DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 SCAS

1.2.2.1 制備

雌性Sprague-Dawley 大鼠20 只，1%苯妥英鈉45 mg/kg 腹腔注射麻醉，無菌條件下經(jīng)心臟灌注無菌PBS。完全取出胸段脊柱，置0 ℃D-hanks 中。取部分完整脊髓(正常脊髓)，修剪為10 mm 左右小段，-20 ℃保存。

取部分脊髓(SCAS)，置-80 ℃冰箱1 h，-20 ℃、4 ℃、37 ℃梯度解凍，無菌蒸餾水浸泡6 h，每2 小時換水1 次。脊髓修剪為10 mm 左右小段，依次浸入2%TritonX-100 溶液，超聲振蕩5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室溫持續(xù)振蕩3 h (170 r/min)；置0.01 mol/L PBS 持續(xù)振蕩3 h；置10%氯化鈉溶液持續(xù)振蕩15 min；置純水持續(xù)振蕩15 min；置10%氯化鈉溶液持續(xù)振蕩15 min；置純水持續(xù)振蕩15 min；置2%脫氧膽酸鈉溶液，超聲振蕩5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室溫持續(xù)振蕩3 h (170 r/min) ；置0.01 mol/L PBS持續(xù)振蕩3 h。-20 ℃保存。

1.2.2.2 檢測

1.2.2.2.1 孔隙率

采用液體置換法。凍干脊髓各5 條置量筒中，加入V1 體積無水乙醇中，輕壓脊髓組織中空氣至無氣泡，此時體積為V2；將脊髓移出，此時體積為V3。

1.2.2.2.2 含水率

凍干脊髓各5 條稱重(W1)，置0.01 mol/L PBS 中浸泡2 h，吸出多余水分，稱重(W2)。

1.2.2.2.3 體外酶解率

凍干脊髓各5 條稱重(W1)，置含1 mg/ml 胰蛋白酶PBS中，37 ℃、100 r/min振蕩24 h取出，凍干后稱重(W2)。

1.2.2.2.4 組織學(xué)觀察

凍干脊髓4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，HE染色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.3 體外共培養(yǎng)

取第3代神經(jīng)球吹散，調(diào)節(jié)細胞濃度為5×106/ml，微量注射器取20μl接種于SCAS 中，培養(yǎng)箱孵育4 h，加分化培養(yǎng)基Neural basal、2% B-27 和10%胎牛血清，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.2.3.1 免疫熒光染色

共培養(yǎng)1 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。DAPI 染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察細胞黏附情況。

1.2.3.2 免疫組化染色

共培養(yǎng)7 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，過氧化氫滅活，5% BSA 封閉，加MAP-2 一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，加生物素標(biāo)記二抗37 ℃0.5 h，SABC 37 ℃0.5 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下觀察細胞生長與分化情況。

1.2.3.3 掃描電鏡

共培養(yǎng)7 d 后，2%戊二醛固定，手術(shù)刀橫向切開，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，粘臺，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡下觀察細胞生長與分化情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件統(tǒng)計分析相關(guān)數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示，采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NSCs鑒定

原代細胞接種6～7 d 后，可見神經(jīng)球增殖、融合變大，直徑可達到150～300 μm，呈球形、桑葚狀，透光性強(圖1A)。第3 代神經(jīng)球95%以上細胞表達Nestin 蛋白(圖1B、圖1C)。分化培養(yǎng)7 d 后，可分化為神經(jīng)樣細胞(圖1D)，表達MAP-2 蛋白(圖1E)和GFAP 蛋白(圖1F)，符合NSCs分化特點。

2.2 SCAS基本特征

正常大鼠脊髓呈圓柱狀，乳白色，稍有黏性(圖2A)。物理振蕩結(jié)合化學(xué)萃取過程中，萃取液變渾濁，脫細胞的脊髓略短縮，呈圓柱狀，乳白色，透光性增加，強度有所下降，黏性略有增加，硬脊膜保持完整(圖2B)。脫細胞脊髓的孔隙率、含水率與體外酶解率較正常脊髓均明顯提高(P<0.01)。見表1。正常脊髓細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，基質(zhì)可見較多完整細胞核(圖2C、圖2D)。SCAS 基質(zhì)結(jié)構(gòu)呈疏松網(wǎng)絡(luò)狀，基質(zhì)上可見極少量殘留細胞核(圖2E、圖2F)。

表1 SCAS與正常脊髓特性比較(%)

2.3 體外共培養(yǎng)

共培養(yǎng)1 d 時，NSCs 散在黏附于支架上(圖3A、圖3B)。共培養(yǎng)7 d 時，NSCs 在支架上逐漸分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞；神經(jīng)元發(fā)育良好，胞體豐滿，形態(tài)各異，軸突清晰，部分神經(jīng)元軸突間建立穩(wěn)定聯(lián)系，形成軸突網(wǎng)絡(luò)(圖3C、圖3D)。共培養(yǎng)7 d 時，細胞良好黏附于支架上，神經(jīng)膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元之下，并分泌相關(guān)物質(zhì)，可見神經(jīng)元軸突間相互連接；神經(jīng)元發(fā)育良好，軸突可深入支架基質(zhì)孔隙中(圖3E、圖3F)。

圖1 NSCs鑒定(bar=100 μm)

圖2 正常脊髓與SCAS形態(tài)學(xué)觀察

3 討論

脊髓損傷康復(fù)臨床路徑包括急性期重建脊柱和神經(jīng)減壓外科治療，以及亞急性和后期綜合康復(fù)[14]。隨著組織工程在各領(lǐng)域研究的日益廣泛，課題組提出脊髓組織工程5R 療法設(shè)想[15]，即先通過外科手術(shù)挽救(Rescue)脊髓功能，隨后引入脊髓組織工程，通過支架上種子細胞促進受損脊髓再生(Regeneration)和替代(Replacement)受損神經(jīng)樣細胞，然后支架的橋接作用增強再髓鞘化(Remyelination)，在各種因素的協(xié)同作用下，獲得最大程度康復(fù)(Rehabilitation)。

圖3 細胞和支架體外共培養(yǎng)

由于脊髓神經(jīng)的特殊性，選擇不同種類細胞與支架進行構(gòu)建可能導(dǎo)致不同結(jié)果。胚胎干細胞與纖維蛋白支架構(gòu)建導(dǎo)致細胞存活率降低，巨噬細胞浸潤增加[16]。在自組裝肽納米纖維支架中培養(yǎng)靈長類NSCs，分化率與常規(guī)培養(yǎng)無顯著性差異[17]。探索適宜的構(gòu)建有重要意義。評估一項新構(gòu)建的效果，通常先進行體外共培養(yǎng)，即將細胞種植在具有三維結(jié)構(gòu)的支架上，使細胞在支架中遷移和生長，最終形成細胞-支架復(fù)合體。

NSCs 是一種組織特異性干細胞，來源于神經(jīng)上皮，具有自我更新和定向分化的潛能。相較其他來源的干細胞，NSCs 更可能定向分化為神經(jīng)譜系細胞[18]。將NSCs 與殼聚糖-明膠支架共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能促進NSCs 的黏附與生長，并向神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞分化[19]。本研究以大腦皮質(zhì)來源的NSCs 作為種子細胞，選用能保持干細胞特性的原代方式進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NSCs 聚集成桑葚狀神經(jīng)球，直徑可達150～300 μm，高于常規(guī)生物材料的內(nèi)部孔隙間距，直接以神經(jīng)球方式接種，難以將NSCs種植入支架內(nèi)，也不便于觀察。可通過常規(guī)傳代時胰酶消化加機械吹打，將神經(jīng)球吹散為單個細胞[20]，但由于消化時間過長或吹打過度等原因，導(dǎo)致NSCs 活力降低甚至凋亡。本課題組采用溫和的Acctuase 酶進行消化，獲得單個的細胞更利于傳代培養(yǎng)與后續(xù)共培養(yǎng)[21]。

已有研究表明[22]，SCAS 可以橋接大鼠受損脊髓，并促進損傷后軸突再生和運動功能康復(fù)。但相對于脫細胞真皮基質(zhì)[23]，脊髓組織脫細胞研究較少，可能與脫細胞時間長(數(shù)十小時)、細胞脫去不徹底、基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞嚴重而引起失敗率較高有關(guān)[24]。目前國內(nèi)外相關(guān)研究多采用物理結(jié)合化學(xué)萃取，輔以交聯(lián)劑對經(jīng)歷長時間脫細胞過程而受損的基質(zhì)結(jié)構(gòu)進行交聯(lián)[25-26]。本課題組實際操作中發(fā)現(xiàn)，該方法存在制備時間過長、交聯(lián)劑可能存在化學(xué)毒性等問題。因此，本研究對SCAS 制備的方法進行優(yōu)化，避免使用未知毒性的交聯(lián)劑，通過調(diào)節(jié)振蕩、凍融等相關(guān)參數(shù)，引入超聲振蕩與高低滲交替輔助裂解細胞法，大大縮短制備時間，并在脫除細胞的情況下最大限度保留基質(zhì)結(jié)構(gòu)。檢測表明，本研究優(yōu)化的脫細胞法可去除絕大部分細胞，較完整保留細胞外基質(zhì)成分與結(jié)構(gòu)。

在此基礎(chǔ)上，本研究將穩(wěn)定傳代的NSCs 與脫去細胞并保留完整基質(zhì)的SCAS用于構(gòu)建脊髓組織工程，觀察細胞在支架上的黏附、生長與分化情況，發(fā)現(xiàn)NSCs 在支架上黏附較好，可在支架上逐漸分化為胞體豐滿、形態(tài)各異、軸突清晰的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，且分化后的神經(jīng)元軸突間建立穩(wěn)定聯(lián)系，形成的軸突網(wǎng)絡(luò)還可深入支架基質(zhì)孔隙中。

綜上所述，本研究制備的SCAS 脫細胞較徹底，具有多通道空間結(jié)構(gòu)，在體外共培養(yǎng)過程中適合NSCs 黏附、生長與分化，構(gòu)建脊髓組織工程具備一定可行性。未來該類構(gòu)建仍需要開展更多動物實驗評估移植后的效果與不良反應(yīng)。相信以NSCs 與SCAS構(gòu)建的脊髓組織工程能夠為康復(fù)醫(yī)學(xué)脊髓損傷領(lǐng)域提供新的應(yīng)用可能。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。