李 娜 陶弘武 柳越冬 林亞南 許博佳 羅瑞娟 王 磊 姜莎莎

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種特發(fā)性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病，發(fā)病率較高。雖然UC的病因尚不清楚，但其特征表現(xiàn)為連續(xù)性腸道黏膜的炎癥，從直腸開始，并可累及整個(gè)結(jié)腸。環(huán)境和生活方式與藥物使用、高糖和高脂肪的飲食、污染、較高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位、壓力與UC有關(guān)，免疫反應(yīng)在UC的全過程中起重要作用。免疫耐受的喪失導(dǎo)致各種免疫炎癥因子的增加而誘發(fā)炎癥。它們刺激抗原特異性效應(yīng)物的增殖，從而觸發(fā)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致局部和全身炎癥。UC的免疫應(yīng)答和炎癥途徑表明，各種類型的細(xì)胞，包括抗原呈遞細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞，通過調(diào)控炎癥在UC發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本文利用GEO數(shù)據(jù)庫中UC的微陣列測序， 并利用CIBERSORT[1]計(jì)算其免疫細(xì)胞組成， 進(jìn)一步分析其與UC的相關(guān)性,并初步評(píng)估 UC中免疫細(xì)胞浸潤情況，為進(jìn)一步研究 UC 的分子機(jī)制提供了新思路。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載 數(shù)據(jù)采集本研究利用了GEO[2]數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的數(shù)據(jù)。MeSH檢索詞為“colitis,ulcerative”或“Ulcerative colitis”和“Homo sapiens”和“Expression profiling by array”和“tissue”，GSE11223微陣列測序數(shù)據(jù)集[3]，樣本通過Agilent-012391全人類基因組Oligo微陣列測序，平臺(tái)文件為GPL1708，包括了67例UC患者腸道不同解剖部位的上皮活檢分析，病理結(jié)果分為炎癥組織和非炎癥組織，剔除非炎癥組織。此外，該數(shù)據(jù)集還包含了31例正常對(duì)照組腸道不同解剖部位上皮組織樣本，剔除其中8個(gè)病理報(bào)告為假膜性結(jié)腸炎、例憩室炎、阿米巴病等[3]炎癥的組織樣本。

1.2數(shù)據(jù)預(yù)處理 使用R軟件[4](version 4.0.3,http://r-project.org/)的affy包[5]分別讀取兩個(gè)數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)，通過RMA算法[6]分別進(jìn)行背景校正、數(shù)據(jù)歸一化處理。然后在Bioconductor[7]應(yīng)用GPL1708平臺(tái)所對(duì)應(yīng)的基因注釋文件對(duì)探針矩陣進(jìn)行注釋。將基因表達(dá)數(shù)據(jù)集是使用標(biāo)準(zhǔn)的注釋文件和數(shù)據(jù)上傳到CIBERSORT網(wǎng)站門戶[8](http://cibersort.stanford.edu/)， CIBERSORT是一種基于基因表達(dá)的反卷積算法[9]中，對(duì)每個(gè)樣本以CIBERSORT值P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選，將過濾后的免疫細(xì)胞表達(dá)矩陣與 GEO的信息矩陣融合,并對(duì)UC的免疫細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3數(shù)據(jù)處理和免疫細(xì)胞浸潤的評(píng)估 在GSE11223微陣列中，原始樣本數(shù)目為202，從UC中剔除病理報(bào)告為非炎癥組織的樣本，獲得63個(gè)樣本；同時(shí)在正常對(duì)照組中，剔除病理報(bào)告為炎癥組織，獲得69個(gè)樣本，應(yīng)用CIBERSORT標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05進(jìn)行過濾，有44個(gè)UC樣本和31個(gè)正常樣本符合過濾條件。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用R語言4.0.3版本，應(yīng)用arrayImpute、arraryMissPattern軟件包處理微陣列缺失值，因缺失數(shù)據(jù)很少，采用簡單插補(bǔ)，即用均值來替換變量中的缺失值。使用barplot函數(shù)繪制其22種浸潤免疫細(xì)胞的占比柱狀圖，應(yīng)用pheatmap包分別分析和繪制免疫細(xì)胞表達(dá)熱圖，采用vioplot包繪制小提琴圖，使用corrplot包繪制不同免疫細(xì)胞間的占比相關(guān)圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1樣本數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化 圖1為GSE11223中69個(gè)正常對(duì)照組樣本和63個(gè)UC組織樣本的基因表達(dá)量，用R 語言的ggplot2包和boxplot函數(shù)繪制未校正的原始箱式圖。隨后進(jìn)一步應(yīng)用affy包和其中的rma函數(shù)，其中normalize.method使用的quantiles方法，無需假設(shè)任何參數(shù)，對(duì)差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及處理，然后以箱式圖(圖2)呈現(xiàn)，使得各個(gè)樣本數(shù)據(jù)處于相同的水平，從而得到具有生物學(xué)意義的基因表達(dá)量的變化情況。

圖1 樣本未經(jīng)校正的原始箱式圖Fig.1 Uncorrected original box diagram of SamplesNote:The graph is GSE11223 in the normal control group (69 samples) and ulcerative colitis patients (63 samples)gene expression level of boxplot.

圖2 樣本表達(dá)校正箱式圖Fig.2 Sample expression correction box diagramNote:The mean value of gene expression after sample normalization[10].

2.2UC組織免疫細(xì)胞占比和含量分析 圖3和圖4聯(lián)合分析所示， 在UC組織中浸潤水平最高的10種免疫細(xì)胞類型分別是:幼稚B細(xì)胞、靜息狀態(tài)下記憶CD4+T細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、靜息狀態(tài)下的肥大細(xì)胞、激活的自然殺傷細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

圖3 GSE11223樣本中22種免疫細(xì)胞占比的柱狀圖Fig.3 Histogram of proportion of 22 kinds of immune cells in GSE11223 samples

2.3對(duì)UC免疫細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析 使用免疫細(xì)胞比例進(jìn)行的無監(jiān)督聚類分析顯示了5個(gè)亞群，如圖4所示。細(xì)胞亞群1由樹突狀細(xì)胞(活化)、肥大細(xì)胞(活化)、自然殺傷細(xì)胞(靜息)、單核細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞構(gòu)成。細(xì)胞亞群2由活化的 CD4+記憶性T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞構(gòu)成。細(xì)胞亞群3由自然殺傷細(xì)胞(活化)、M2巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞(靜息)組成。細(xì)胞亞群4由M0巨噬細(xì)胞、γδT細(xì)胞組成。細(xì)胞亞群5由幼稚B細(xì)胞、靜息狀態(tài)下記憶CD4+T細(xì)胞組成。研究表明，相對(duì)于細(xì)胞亞群3和細(xì)胞亞群4功能的失調(diào)，細(xì)胞亞群1、細(xì)胞亞群2的活躍，上述主要細(xì)胞亞群的變化差異是UC的發(fā)生發(fā)展的直接原因。

圖4 GSE11223樣本中22 種免疫細(xì)胞含量熱圖Fig.4 Heatmap of 22 immune cells in GSE11223 samplesNote:The blue control group represents the normal control group,and the red Treat group represents ulcerative colitis group.

2.4免疫細(xì)胞在正常對(duì)照組和UC組的比例差異 與UC組織相比，在正常組織中，M2巨噬細(xì)胞、未活化的樹突狀細(xì)胞的比例普遍較高(P<0.05)。與正常組織相比，在UC組織中活化的 CD4+記憶性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞的比例普遍較高(P<0.05)，見圖5。

圖5 樣本免疫細(xì)胞占比小提琴圖Fig.5 Proportion of immune cells in a violin diagramNote:Samples of normal control group and inflammatory tissue samples of patients with ulcerative colitis from GSE11223.Green represents normal control group,blue represents ulcerative colitis group.

2.5UC組織免疫細(xì)胞的相關(guān)分析 圖6可見，在UC組織中，構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大的免疫細(xì)胞包括:負(fù)相關(guān)的可見未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞(-0.5)，未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞與活化的CD4+記憶性T細(xì)胞(-0.43)，幼稚B細(xì)胞與漿細(xì)胞(-0.52)，幼稚B細(xì)胞與記憶B細(xì)胞(-0.49)，幼稚B細(xì)胞與M1巨噬細(xì)胞(-0.49)，M2巨噬細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞(-0.56)，以上負(fù)相關(guān)提示活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞與未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞之間在UC疾病進(jìn)程中相互抑制。正相關(guān)的可見活化的肥大細(xì)胞與活化的樹突細(xì)胞(0.64)，活化的肥大細(xì)胞與中性粒細(xì)胞(0.47)，活化的樹突細(xì)胞與中性粒細(xì)胞(0.42)，上述正相關(guān)提示活化的樹突細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞三種免疫細(xì)胞在UC疾病過程中具有相互協(xié)同作用的關(guān)系。

圖6 UC組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比相關(guān)圖Fig.6 Correlation of proportion of each immune cell in ulcerative colitis tissue samples

3 討論

UC是一種慢性結(jié)腸特發(fā)性炎癥性腸病，可引起從直腸向近端結(jié)腸持續(xù)的黏膜炎癥，且炎癥程度不一，UC接受藥物治療的患者需要持續(xù)長時(shí)間應(yīng)用皮質(zhì)類固醇控制，因此解決UC免疫反應(yīng)成為當(dāng)務(wù)之急。固有免疫是病原微生物入侵腸道黏膜的第一道防線。本研究從全人類基因組Oligo微陣列數(shù)據(jù)分析的角度開展。在正常組織中，巨噬細(xì)胞M2(P=0.014)、靜息樹突狀細(xì)胞(P=0.012)高表達(dá)。而UC參與固有免疫的特征性細(xì)胞有單核細(xì)胞(P=0.037)、巨噬細(xì)胞M0(P=0.001)、中性粒細(xì)胞(P=0.011)，上述細(xì)胞初次與抗原接觸即能發(fā)揮效應(yīng)，但無記憶性，也是特異性免疫的基礎(chǔ)。

在談到特異性免疫時(shí)，樹突狀細(xì)胞一直被認(rèn)為是體內(nèi)唯一能夠?qū)⒖乖岢式o初始狀態(tài)CD4+T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為適應(yīng)性免疫反應(yīng)，活化的樹突狀細(xì)胞停留在上皮屏障附近，和黏膜固有層的巨噬細(xì)胞一起激活局部適應(yīng)性反應(yīng)[11]?，F(xiàn)在已有研究證實(shí)B細(xì)胞表達(dá)的Toll樣受體及其信號(hào)通路對(duì)CD4+T細(xì)胞的活化和分化發(fā)揮著關(guān)鍵作用，刷新了CD4+T細(xì)胞對(duì)抗病原微生物過程的反應(yīng)的認(rèn)識(shí)[12]。

圖7系統(tǒng)地展示了本研究的結(jié)果。在本項(xiàng)研究中，CD4+記憶性T細(xì)胞在UC與正常組織之間存在顯著差異(P<0.05)，在UC組織中，CD4+記憶性T細(xì)胞的比例普遍高于正常組織。生理正常狀態(tài)下，CD4+記憶性T細(xì)胞是體液免疫中由B細(xì)胞分化而來的一種免疫細(xì)胞。CD4+記憶性T細(xì)胞在抗原二次感染細(xì)胞時(shí)，可直接增殖、分化產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞。CD4+記憶性T細(xì)胞可在人體內(nèi)存在數(shù)月，甚至幾十年，使人體避免受到相應(yīng)病原體的二次侵入。研究證實(shí)病理狀態(tài)下，腸道內(nèi)CD4+T細(xì)胞[13]、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤，CD4+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的基線百分比與UC結(jié)局相關(guān)[14]。 CD4記憶效應(yīng)T細(xì)胞,可以導(dǎo)致IL-7表達(dá)水平增高,誘導(dǎo)腸道黏膜固有層炎癥發(fā)生。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的IL-8+Foxp3+細(xì)胞亞群在UC的微環(huán)境中，不僅抑制人體免疫反應(yīng)，還可誘導(dǎo)關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子，調(diào)動(dòng)中性粒細(xì)胞聚集和轉(zhuǎn)運(yùn)，中性粒細(xì)胞表達(dá)量的顯著差異,從側(cè)面支持了中性粒細(xì)胞在急性黏膜炎癥和損傷中扮演重要角色,由于大量炎癥細(xì)胞存在于結(jié)腸導(dǎo)致的隱窩膿腫[15-17]。甚至促進(jìn)啟動(dòng)潰瘍性大腸癌的發(fā)生。

圖7 基于GSE11223微陣列數(shù)據(jù)集，UC免疫特征性細(xì)胞在固有性免疫及特異性免疫的差異表達(dá)Fig.7 Based on GSE11223 data set, characteristic cells in UC were differentially expressed in innate immuni-ty and specific immunityNote:① In UC tissue, antigen-presenting cells (dendritic cells, macrophages, B cells) react with naive CD4+T cells，which activated CD4+T cells (P<0.05); ②TLR signal expressed by B cells also promotes the activation of CD4+T cells;③CD4+ memory T cells showed significant difference between ulcerative colitis and normal tissue (P<0.05);④The characteristic expression of macrophage M2 is decreased in UC (P<0.05), considering that the polarization of M2 induced by PPAR is inhibited[26-29];⑤The characteristic cells involved in the innate immunity of UC are monocytes (P=0.037), macrophage M0 (P=0.001) and neutrophils (P=0.011).

盡管目前有研究指出UC患者巨噬細(xì)胞表型向M1轉(zhuǎn)移，呈現(xiàn)高促炎細(xì)胞因子分泌，可增強(qiáng)細(xì)胞毒性和吞噬能力[18，19]。而本研究表明，M1巨噬細(xì)胞在UC與正常組織之間不存在顯著差異(P>0.05，圖5所示)。在UC組織中M0巨噬細(xì)胞的比例普遍較高(P<0.05)。而在UC組織中M2巨噬細(xì)胞的比例普遍較低(P<0.05)。在一項(xiàng)對(duì)兒童UC研究的芯片數(shù)據(jù)集GSE87473進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析顯示[20]，兒童UC中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞比例較高，而M2巨噬細(xì)胞和活化樹突狀細(xì)胞比例在UC的患者中較低，在該項(xiàng)研究中，M1巨噬細(xì)胞也不存在特征性差異，與本研究分析結(jié)果具有一致性。目前已知M2 巨噬細(xì)胞,參與了潰瘍性大腸癌腫瘤血管生成，在克隆恩病和結(jié)直腸癌中高表達(dá)，其發(fā)生機(jī)制為IL-4/IL-13和IL-10激活STAT3和STAT6時(shí)，增加巨噬細(xì)胞M2的極化水平有關(guān)[21-23]。但作為巨噬細(xì)胞M2的轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ缺失均導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M2極化受到抑制[24,25]，目前也被認(rèn)為是導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M2在潰瘍性結(jié)腸炎中特征性低表達(dá)的原因之一[26-29]。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析技術(shù)，基于CIBERSORT研究方法，分析了正常結(jié)腸組織和UC組織的全人類基因組Oligo微陣列測序，它提供關(guān)于UC免疫細(xì)胞的明確信息。

本研究結(jié)果表明，CD4+記憶性 T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2型、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而這些特征性免疫細(xì)胞可能是藥物治療作用效應(yīng)的重要決定因素，也是免疫治療評(píng)估的中心焦點(diǎn)，更能為UC患者的治療評(píng)估策略提供標(biāo)志性參考。