侯俊勝，豆彪，陶學(xué)勇，翟性友

1河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河南 開封 475000

2解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海南 三亞572013

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%。近年來，盡管以手術(shù)為主的綜合治療方案使喉癌患者預(yù)后得到改善，但其遠(yuǎn)期生存率并未見明顯提高，尤其是伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，其5年生存率不足50%[1-2]。闡明喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探尋分子靶向標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)靶向治療是提高喉癌患者生存率的關(guān)鍵。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的非編碼內(nèi)源性小分子RNA，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)向調(diào)控，研究顯示，miRNA與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)[3-5]。miRNA-384在多種惡性腫瘤中存在明顯異常表達(dá)，被認(rèn)為是一種抑癌miRNA，能夠抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[6-7]。miRNA-let-7a在肝癌、前列腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，也是一種抑癌miRNA，可通過作用于高遷移率族蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用[8-9]。但在喉癌中，miRNA-384、miRNA-let-7a表達(dá)是否對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有影響，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。為此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a的表達(dá)水平，分析其與患者臨床特征的關(guān)系，探討其對(duì)預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年6月至2014年6月在河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的喉癌患者的病歷資料。所有患者均具有完整病歷資料及隨訪資料，術(shù)前均未接受放化療及免疫治療，且均采集喉癌組織及癌旁正常組織（距腫瘤組織0.5～1.0 cm）標(biāo)本。共納入80例喉癌患者，其中，男72例，女8例；年齡36～83歲，中位年齡59歲；病理類型均為喉鱗狀細(xì)胞癌，高分化癌48例，中分化癌28例，低分化癌4例；原發(fā)部位：聲門上型18例，聲門型52例，聲門下型10例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期31例，Ⅳ期17例。全部標(biāo)本均于手術(shù)切取離體后置入液氮中，轉(zhuǎn)運(yùn)至-80℃冰箱中保存。

1.2 儀器與試劑

熒光定量PCR儀購自美國Thermo Forma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；PCR引物由南京金斯瑞公司設(shè)計(jì)合成；-80℃低溫冰箱購自無錫冠亞恒溫制冷技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

總RNA的提取：①組織勻漿。取組織標(biāo)本約100 mg，放置到EP管中，加入Trizol試劑1 ml，冰上操作勻漿至液態(tài)。靜置5 min后，4℃環(huán)境下離心（12 500 r/min，5 min）。②兩相分離。吸取1.5 ml組織上清液到新的離心管（1.5 ml）中，加入200 μl氯仿，輕輕振蕩EP管，混勻，EP管液體為粉紅色乳狀，室溫靜置5 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min），此時(shí)液體分為3層，其中RNA全部溶解于上層水相。③RNA沉淀。取離心后的上層水相，移至新的EP管（1.5 ml）中，加入異丙醇，充分混勻，靜置10 min，4℃環(huán)境下離心（12 000 r/min，10 min）。④RNA洗滌。吸除上清液，可見EP管底部沉淀有白色物質(zhì)，加入1 ml無水冰乙醇，輕彈EP管底部使白色沉淀物充分洗滌，振蕩，4℃環(huán)境下離心（12 000 r/min，15 min）。離心后肉眼可見EP管底部存在少量白色沉淀物質(zhì)，將上清液棄掉，將EP管置于超凈臺(tái)中20 min，使RNA干燥。⑤RNA沉淀重新溶解。采用移液槍往RNA沉淀中加入RNA-free H2O，反復(fù)吹打數(shù)次，于55～60℃下孵育10 min。取2 μl溶解液進(jìn)行RNA測(cè)定，將得到的RNA溶解液置于-80℃環(huán)境下保存。

qRT-PCR檢測(cè)喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a的表達(dá)：采用qRT-PCR法，以兩步法檢測(cè)miRNA-384、miRNA-let-7a表達(dá)量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用通用的反轉(zhuǎn)錄條件轉(zhuǎn)錄目的miRNA，95℃ 30 s、95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，以2-ΔCt表示miRNA-384、miRNA-let-7a的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織與癌旁正常組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相對(duì)表達(dá)量的比較

喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a相對(duì)表達(dá)量均明顯低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 喉癌組織與癌旁正常組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組織喉癌組織（n=80）癌旁正常組織（n=80）t值P值0.56±0.18 1.37±0.39 16.867 0.000 0.51±0.16 2.36±0.58 27.502 0.000 miRNA-384miRNA-let-7a

2.2 喉癌組織中miRNA-384與miRNA-let- 7 a表達(dá)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，喉癌組織中miRNA-384相對(duì)表達(dá)量與miRNA-let-7a相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.457，P＜0.05）。

2.3 不同臨床特征的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相對(duì)表達(dá)量的比較

臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384相對(duì)表達(dá)量分別明顯高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.738、3.567，P＜0.01）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-let-7a相對(duì)表達(dá)量分別明顯高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.445、2.991，P＜0.01）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、原發(fā)部位、分化程度及有無吸煙史喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的喉癌患者的喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let- 7 a的相對(duì)表達(dá)量（ n=80）

2.4 生存分析

隨訪截至2019年10月，中位隨訪時(shí)間39個(gè)月（5～60個(gè)月）。根據(jù)喉癌組織中miRNA-384、miRNA-let-7a相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)，定義miRNA-384 0.46為低表達(dá)（n=35），＞0.46為高表達(dá)（n=45）；并定義miRNA-let-7a≤0.42為低表達(dá)（n=31），＞0.42為高表達(dá)（n=49）。miRNA-384高表達(dá)患者術(shù)后5年生存率為84.3%，明顯高于低表達(dá)患者的66.2%；miRNA-let-7a高表達(dá)患者術(shù)后5年生存率為82.9%，明顯高于低表達(dá)患者的64.8%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1、圖2）

3 討論

局部復(fù)發(fā)及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是限制喉癌治療效果進(jìn)一步提高的瓶頸。目前，喉癌的病因仍未完全明確，如何在分子水平闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探尋新的靶向治療方法是臨床研究之熱點(diǎn)。

圖1 miRNA-384高表達(dá)（ n=45）與miRNA-384低表達(dá)（ n=35）喉癌患者的生存曲線

圖2 miRNA-let- 7 a高表達(dá)（ n=49）與miRNA-let- 7 a低表達(dá)（ n=31）喉癌患者的生存曲線

miRNA是一類真核生物內(nèi)源性非編碼單鏈的小RNA分子，長(zhǎng)19～23個(gè)核苷酸。研究表明，盡管miRNA在人體基因數(shù)中僅占2%，卻對(duì)30%以上的人體基因表達(dá)有著調(diào)控作用，介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程，與多種疾病的發(fā)生、進(jìn)展緊密關(guān)聯(lián)[10-11]。miRNA-384被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子。目前，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)，miRNA-384表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CRNDE通過抑制miRNA-384表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，提示miRNA-384參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。Zhang等[13]研究顯示，miRNA-384能夠靶向抑制AKT3表達(dá)而抑制大腸癌細(xì)胞增殖。研究認(rèn)為，miRNA-384是潛在的抑癌因子，在多種致癌信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[14]。且已有研究顯示，喉癌組織中miRNA-384表達(dá)明顯降低[15]。本研究顯示，與癌旁正常組織相比，喉癌組織中miRNA-384相對(duì)表達(dá)量明顯降低，且臨床分期越晚、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的喉癌組織中miRNA-384相對(duì)表達(dá)量相對(duì)越低，提示miRNA-384表達(dá)下調(diào)與喉癌發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

miRNA-let-7a作為較早被發(fā)現(xiàn)的miRNA家族重要成員，可通過與靶mRNA進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，抑制蛋白翻譯過程，對(duì)內(nèi)源蛋白表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而參與基因調(diào)控[16]。在胚胎期組織中，miRNA-let-7a表達(dá)較少，而在分化成熟的組織中，其表達(dá)逐漸增多。有研究提示，miRNA-let-7a也可能是一種抑癌因子，在一系列致癌信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[17]。miRNA-let-7a被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)，其低表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)，且低表達(dá)miRNA-let-7a的癌癥患者生存率較低[18]。眾多證據(jù)表明，miRNA-let-7a在惡性腫瘤中有著強(qiáng)大的抑癌基因功能。Tang等[19]研究顯示，miRNA-let-7a可通過抑制丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Guo等[20]也發(fā)現(xiàn)，miRNA-let-7a可通過下調(diào)PKM2表達(dá)而抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Liu等[21]研究表明，miRNA-let-7a可通過介導(dǎo)高遷移率族蛋白A2（high-mobility group protein A2，HMGA2）表達(dá)，而對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移產(chǎn)生抑制作用。本研究應(yīng)用qRT-PCR對(duì)喉癌組織及癌旁正常組織中miRNA-let-7a表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA-let-7a在喉癌組織中表達(dá)明顯降低，且晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的喉癌組織中miRNA-let-7a相對(duì)表達(dá)量分別明顯低于早期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示miRNA-let-7a表達(dá)下調(diào)，可能參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展，這可能是喉癌發(fā)生的重要分子機(jī)制，有望成為靶向治療的新靶點(diǎn)。本研究對(duì)miRNA-384與miRNA-let-7a的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，二者呈正相關(guān)，二者表達(dá)下調(diào)可能共同促進(jìn)了喉癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究還對(duì)患者5年生存情況與這兩種基因表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，miRNA-384高表達(dá)患者術(shù)后5年生存率為84.3%，明顯高于低表達(dá)患者的66.2%；miRNA-let-7a高表達(dá)患者術(shù)后5年生存率為82.9%，明顯高于低表達(dá)患者的64.8%；提示miRNA-384、miRNA-let-7a高表達(dá)有利于患者預(yù)后。由此推測(cè)miRNA-384與miRNA-let-7a可作為判斷喉癌病理進(jìn)程及預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。綜上所述，本研究顯示，miRNA-384、miRNA-let-7a在喉癌組織中均呈低表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，這將有助于深入研究喉癌的發(fā)病機(jī)制，并為臨床診療提供更多策略及思路。