徐 洋 晁文池 宋寶莉 高江力

1 甘肅省蘭州市中醫(yī)醫(yī)院 730000； 2 西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部

齲病是一種重要的口腔疾病，其不但會對牙體硬組織進(jìn)行慢性破壞，而且還是消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病、過敏性紫癜等多種全身性疾病的危險因素，同時，齲病也是人群中發(fā)病率最高的疾病之一[1]。相關(guān)研究已證實(shí)細(xì)菌是齲病的主要致病因素，其中變異鏈球菌(Streptococcus mutans)由于可在口腔中通過產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物發(fā)酵糖類并產(chǎn)酸，且其代謝產(chǎn)物中包含多種致齲相關(guān)的致病因子，成了目前已經(jīng)明確的齲病致病菌[2-4]。利用傳統(tǒng)的抑菌藥物抑制變異鏈球菌往往會破壞口腔微生態(tài)，很難達(dá)到理想的效果[5]?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是在人體內(nèi)廣泛存在的非致病菌，其代謝產(chǎn)物中包含多種抑菌物質(zhì)，能夠廣譜地抑制病原菌，并在人體內(nèi)多個部位維持微生態(tài)的平衡[6-8]。已有研究從口腔中分離培養(yǎng)得到了枯草芽孢桿菌，并表明幾種口腔致病菌的生長受到了枯草芽孢桿菌的抑制[9]。揭示變異鏈球菌的生長受枯草芽孢桿菌抑制的機(jī)制對于齲病的治療及預(yù)防有著非常重要的意義。

利用代謝組學(xué)技術(shù)可對相對分子質(zhì)量較低的微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面的分析，且可反映微生物在此過程中真實(shí)的生理動態(tài)[10-11]，是揭示枯草芽孢桿菌對變異鏈球菌生長抑制機(jī)制的有力工具。因此，本研究采用基于1H核磁共振波譜(Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)的代謝組學(xué)方法對變異鏈球菌菌液及與枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物提取液共培養(yǎng)的變異鏈球菌菌液的代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較分析，以期初步揭示枯草芽孢桿菌抑制變異鏈球菌生長的機(jī)制，為探求安全、有效的齲病防治藥物提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)方法 變異鏈球菌S.mutans ATCC25157和枯草芽孢桿菌B. subtilis CMCC63501由西北民族大學(xué)甘肅省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。變異鏈球菌在牛腦心浸液(Brain heart infusion broth，BHI)培養(yǎng)基，37℃厭氧條件培養(yǎng)?？莶菅挎邨U菌采用枯草芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基T2培養(yǎng)基，37℃進(jìn)行培養(yǎng)[12]。

1.2 枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的提取 取生長24h的枯草芽孢桿菌菌液，在4℃下3 000r/min離心5 min，吸取上清并用22μm濾器過濾。

1.3 生長曲線的建立 將BHI培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)12h的菌體離心收集，之后用PBS磷酸緩沖液重懸并調(diào)OD570至0.08。準(zhǔn)備24管BHI培養(yǎng)基和24管加入枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的BHI培養(yǎng)基，每管10ml。分別將0.05ml重懸后的菌液加入每管培養(yǎng)基，每小時取1管測定OD值構(gòu)建生長曲線。

1.4 胞外代謝產(chǎn)物的收集及處理 分別收集培養(yǎng)24h處于穩(wěn)定期的變異鏈球菌及與枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物共培養(yǎng)的菌液，在4℃、15 000r/min離心10min，將上清液提取后加入PBS磷酸緩沖液(1∶2)并靜置5min。再4℃、15 000r/min離心10min，取上清0.5ml并與0.25ml重水混勻后置于核磁管內(nèi)，保存于-80℃冰箱，測定前取出并保持在0℃左右，使用DRX600超導(dǎo)傅里葉變換NMR儀進(jìn)行測定。

1.51H NMR的數(shù)據(jù)采集及分析 在配備了5mm PATXI探針，600.13 MHz質(zhì)子頻率的Bruker Avance Ⅱ 600波譜儀(Bruker公司，德國)上記錄細(xì)胞外代謝物的1H NMR(300K)。隨后在樣點(diǎn)數(shù)64 000，譜寬9 001.95Hz下采用兩個脈沖序列獲得光譜[13]。對1H NMR的失真基線和相位進(jìn)行手動校準(zhǔn)。利用MestReC-v4.8軟件將獲得的原始自由感應(yīng)衰減信號(Free induction decay，F(xiàn)ID)數(shù)據(jù)進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)換(Fourier transition，F(xiàn)T)獲得1H-NMR圖譜，并對1H-NMR譜進(jìn)行分段積分得到積分值，將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化[14]，隨后通過Canoco 5.0軟件進(jìn)行主成分分析(Principal components analysis，PCA)。

2 結(jié)果

2.1 變異鏈球菌受枯草芽孢桿菌代謝物影響下的生長曲線 單獨(dú)培養(yǎng)的變異鏈球菌以及與枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物共同培養(yǎng)的變異鏈球菌初始濃度相同，在進(jìn)入對數(shù)期后變異鏈球菌生長受到明顯抑制，在培養(yǎng)12h后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1)。

圖1 變異鏈球菌受枯草芽孢桿菌代謝物影響下的生長曲線

2.2 胞外代謝產(chǎn)物分析1H NMR分析結(jié)果顯示化學(xué)位移在δ0×10-6～10×10-6范圍內(nèi)存在大量胞外代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物主要包括亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等(圖2)。

圖2 胞外代謝產(chǎn)物的1H NMR分析

2.3 胞外代謝產(chǎn)物的主成分分析(PCA) 將胞外代謝產(chǎn)物1H NMR分析結(jié)果的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，從分析結(jié)果可以看出變異鏈球菌單獨(dú)培養(yǎng)與共培養(yǎng)樣點(diǎn)在PCA圖上分為了兩簇(圖3)，這表明與枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物共培養(yǎng)后，變異鏈球菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生了改變，這些存在差異的代謝產(chǎn)物可能包含了亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等。

圖3 胞外代謝產(chǎn)物的主成分分析

黑色圓點(diǎn)：變異鏈球菌 紅色圓點(diǎn)：變異鏈球菌+枯草芽孢桿菌

3 討論

本研究提取了枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物，并將其與變異鏈球菌共培養(yǎng)，從測得的細(xì)菌生長曲線可以看出與單獨(dú)培養(yǎng)的變異鏈球菌相比，共培養(yǎng)的變異鏈球菌生長受到了抑制(圖1)，這表明枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生抑制變異鏈球菌生長的代謝產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌的抑菌作用已經(jīng)在很多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[15]，尋找并利用能夠抑制變異鏈球菌生長的代謝產(chǎn)物對齲病的防治具有重要意義。

為了揭示枯草芽孢桿菌抑制變異鏈球菌生長可能存在的機(jī)制，筆者從代謝組學(xué)的角度分析了變異鏈球菌單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)的代謝產(chǎn)物。1H NMR結(jié)果的主成分分析表明了其兩者之間存在差異(圖3)，而這些表達(dá)存在差異的重要代謝產(chǎn)物可能是亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等(圖2)。變異鏈球菌致齲的關(guān)鍵毒力因子包含了胞外多糖合成、產(chǎn)酸、耐酸、黏附及形成生物膜等[2]。乳酸是致齲的關(guān)鍵因素，牙表面乳酸的形成可降低pH并導(dǎo)致齲齒的形成[16]。而亮氨酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等均為三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，它們與細(xì)菌的生長與繁殖密切相關(guān)[17]。通過本研究的結(jié)果筆者認(rèn)為枯草芽孢桿菌可能通過產(chǎn)生能夠影響變異鏈球菌糖代謝和氨基酸代謝的產(chǎn)物，從而抑制了變異鏈球菌的生長。一方面，變異鏈球菌的生長及增殖受到了抑制，使其作為齲病的重要致病菌從數(shù)量上得以減少。另一方面，變異鏈球菌的糖酵解途徑受到影響，使其產(chǎn)生的毒力因子作用降低。

本研究利用1H NMR代謝組學(xué)分析為揭示枯草芽孢桿菌抑制變異鏈球菌生長可能存在的機(jī)制提供了理論依據(jù)，然而要明確發(fā)生改變的代謝產(chǎn)物并對其進(jìn)行定量還需要進(jìn)行精確的靶向代謝組學(xué)分析。未來的研究還需結(jié)合多組學(xué)對該機(jī)制進(jìn)行完整的揭示，以期為齲病的治療提供安全、有效的藥物，以及提出新的研究思路。