高 揚(yáng)，李 卉，劉曉兵，馬 波，馬 云，宋 輝,2

卵巢的正常發(fā)育是雌性動(dòng)物生殖能力的重要保證，其中卵泡發(fā)育與雌性動(dòng)物的發(fā)情周期、卵母細(xì)胞質(zhì)量以及受精成功率和胚胎成活率密切相關(guān)[1]。有研究證明，熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致雌性動(dòng)物卵巢功能減退，生殖激素分泌水平下降進(jìn)而引起發(fā)情延遲或不發(fā)情，受胎率和產(chǎn)仔率下降等危害[2-6]。在正常生理環(huán)境下，卵泡發(fā)育主要受下丘腦-垂體-卵巢軸分泌激素的調(diào)控[7]。當(dāng)受到熱應(yīng)激刺激后，雌性動(dòng)物下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)減少，垂體分泌的卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)受到抑制，卵泡發(fā)育受阻，繼而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，降低生殖潛能[8-9]。本研究以雌性幼年ICR小鼠為研究對(duì)象，模擬午后高溫環(huán)境，觀察熱應(yīng)激對(duì)小鼠生長(zhǎng)各個(gè)階段卵巢發(fā)育、卵泡閉鎖以及發(fā)情周期的影響，為研究熱應(yīng)激對(duì)雌性動(dòng)物生殖發(fā)育的影響提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：動(dòng)物術(shù)后保溫箱(中國(guó)玉研儀器，型號(hào)：5103)，電子天平(上海精科，型號(hào)：FA2004B)，石蠟切片機(jī)(Leica，型號(hào)：RM2235)，顯微鏡(Olympus，型號(hào)：U-RFL-T)，HE染色試劑盒(碧云天公司，貨號(hào)：C0105)，PBS緩沖液(Solarbio，貨號(hào)：P1020-500 ml)，多聚甲醛(Solarbio，貨號(hào)：P1110-500 ml)，無(wú)水乙醇、二甲苯、載玻片、蓋玻片、槍頭、離心管等試劑耗材均購(gòu)自銀川偉博鑫生物科技有限公司。

3.4 本研究意義及局限 本研究編制了綜合醫(yī)院護(hù)士工作滿意度量表，共包含2個(gè)維度16個(gè)條目，并進(jìn)行了信效度的檢驗(yàn)。本量表的編制過程符合量表開發(fā)流程，并且經(jīng)過初步的嚴(yán)格探索分析，驗(yàn)證該量表具有良好的信效度，可以全面反應(yīng)護(hù)士工作滿意度，對(duì)于推進(jìn)護(hù)理管理工作的改革及降低離職率具有重要意義。由于條件所限，未進(jìn)行驗(yàn)證性因子分析，對(duì)于維度分布情況有待進(jìn)一步驗(yàn)證，今后在更多樣本、更廣范圍上進(jìn)一步驗(yàn)證其信效度，并建立全國(guó)常模。

1.2 方法

The plot for the forthcoming analysis is given in Fig. 8.

1.2.1 小鼠飼養(yǎng)管理及分組：36只2周齡幼年雌性ICR小鼠，體重(11.06±0.81)g，均購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本課題獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意。小鼠預(yù)飼1周后，隨機(jī)分為熱應(yīng)激組(18只，每天中午12:00至14:00放置于40 ℃通風(fēng)正常的動(dòng)物術(shù)后保溫箱中)和對(duì)照組(18只，室溫環(huán)境)，保證水和食物充足，其他飼養(yǎng)條件完全相同。分別在6周齡(青春期)、9周齡(性成熟)和12周齡(成年期)每組中隨機(jī)抽取6只小鼠進(jìn)行采樣。

組織承諾是個(gè)人對(duì)所屬組織的目標(biāo)和價(jià)值觀的認(rèn)同和信任，以及由此帶來(lái)的積極情感體驗(yàn)。組織承諾的提升，有助于降低員工流失率、缺勤率，有助于員工績(jī)效和組織績(jī)效的提升，更能有效的激發(fā)員工的主動(dòng)性和創(chuàng)新能力。

1.2.4 卵巢組織切片HE染色和卵泡計(jì)數(shù)：將小鼠卵巢置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋處理。將包埋好的卵巢組織進(jìn)行連續(xù)矢狀切片，切片厚度8 μm，每隔20張取一張切片進(jìn)行HE染色和卵泡計(jì)數(shù)。由于原始卵泡數(shù)目眾多計(jì)數(shù)不準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)只記錄初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及相應(yīng)的閉鎖卵泡[13]。為了避免重復(fù)計(jì)數(shù)，只記錄那些能觀察到卵母細(xì)胞的細(xì)胞核的卵泡。卵泡閉鎖率=(閉鎖卵泡數(shù)目/總卵泡數(shù)目)×100%

2.3 熱應(yīng)激對(duì)小鼠發(fā)情周期的影響：根據(jù)小鼠陰道外觀及陰道涂片結(jié)果顯示，確定小鼠的發(fā)情周期。結(jié)果為熱應(yīng)激組發(fā)情周期(5.29±0.19)d，對(duì)照組發(fā)情周期為(5.5±0.22)d，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2.2 體重、卵巢重及卵巢比重的測(cè)量：稱量并記錄小鼠體重，然后處死，立即取出雙側(cè)卵巢，清除周圍多余脂肪，使用分析天平稱量每只鼠的雙側(cè)卵巢重量，卵巢比重=卵巢重(g)/體重(g)。

2.1 熱應(yīng)激對(duì)小鼠卵巢發(fā)育的影響:由表1可知，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組小鼠在6周齡和9周齡體重、卵巢重及卵巢比重均為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12周齡時(shí)，熱應(yīng)激組小鼠體重[(31.43±1.33)g vs(38.02±2.66)g，P<0.05]和卵巢重量[(0.023±0.002)g vs(0.029±0.002)g,P<0.05]顯著降低(P>0.05)。

2 結(jié)果

表1 熱應(yīng)激對(duì)小鼠卵巢發(fā)育的影響

2.2 熱應(yīng)激對(duì)小鼠卵泡閉鎖的影響:通過觀察小鼠卵巢切片(圖1，目錄后)統(tǒng)計(jì)小鼠的卵泡數(shù)目(表2)，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組小鼠的初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的總數(shù)及相應(yīng)閉鎖卵泡數(shù)目差異不顯著(P>0.05)。但9周齡時(shí)，熱應(yīng)激組小鼠的次級(jí)卵泡閉鎖率顯著高于對(duì)照組[(51.22±4.37)% vs(43.69±5.41)%，P<0.05]，12周齡時(shí)，熱應(yīng)激組的次級(jí)卵泡閉鎖率顯著高于對(duì)照組[(55.49±3.19)% vs(49.86±3.84)%，P<0.05]。

由于并聯(lián)機(jī)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)緊湊、承載能力強(qiáng)、剛度大、慣性力小、精度高、響應(yīng)和運(yùn)動(dòng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，多為現(xiàn)代多自由度力控末端執(zhí)行器所用[4]。然而，傳統(tǒng)的并聯(lián)機(jī)構(gòu)構(gòu)型設(shè)計(jì)依賴于數(shù)學(xué)推演和物理機(jī)制，難度大且復(fù)雜，采用封閉解和數(shù)值解等運(yùn)動(dòng)學(xué)正解的分析方法難以同時(shí)得到全部解和實(shí)用解，且求解過程復(fù)雜、精度低和適應(yīng)性差；傳統(tǒng)設(shè)計(jì)中，尺度參數(shù)多且量綱復(fù)雜，優(yōu)化目標(biāo)多樣，目標(biāo)函數(shù)建模難度大。因此，研究適用于力控末端執(zhí)行器的新型并聯(lián)機(jī)構(gòu)構(gòu)型綜合理論與優(yōu)化技術(shù)對(duì)設(shè)計(jì)高精度多自由度力控末端執(zhí)行器具有重要意義。

表2 熱應(yīng)激對(duì)小鼠卵泡閉鎖的影響

1.2.3 陰道外觀與陰道涂片鑒定小鼠發(fā)情周期：從11周齡開始，熱應(yīng)激組和對(duì)照組中各取6只小鼠進(jìn)行標(biāo)號(hào)，每天早晨7：00和晚上19：00進(jìn)行陰道外觀和陰道涂片觀察小鼠發(fā)情周期。將小鼠翻提，觀察外陰，用移液器吸10 μl PBS 滴入陰道口，輕輕抽吸幾下，將回收液制成涂片，晾干后進(jìn)行HE染色，觀察陰道脫落的上皮細(xì)胞形態(tài)。通過以上兩種方法共同確定小鼠的發(fā)情周期[10-12]，前一次發(fā)情期開始到下次發(fā)情期的到來(lái)為一個(gè)發(fā)情周期，確保記錄一個(gè)完整的發(fā)情周期。

3 討論

高溫環(huán)境下，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)非特異性應(yīng)激反應(yīng)，生殖能力和生理狀態(tài)受到嚴(yán)重影響。在雌性動(dòng)物體內(nèi)主要表現(xiàn)為生殖激素分泌不足、卵巢功能障礙、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、發(fā)情障礙、受精率下降、胚胎發(fā)育不良等，進(jìn)而導(dǎo)致生育力下降[2-5]。卵巢的發(fā)育和功能受到下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO)調(diào)控，對(duì)溫度改變敏感[9]。本試驗(yàn)?zāi)M體外高溫環(huán)境，研究熱應(yīng)激對(duì)幼齡小鼠卵巢發(fā)育和生長(zhǎng)卵泡數(shù)目及其閉鎖率的影響。結(jié)果顯示，12周齡時(shí)，相較于對(duì)照組，熱應(yīng)激組小鼠體重和卵巢重量顯著降低(P<0.05)。

研究表明，雌性奶牛下丘腦通過分泌GnRH，調(diào)節(jié)垂體釋放LH和FSH，從而影響性激素的分泌和卵巢的發(fā)育[14]。FSH可以作用于生長(zhǎng)卵泡促進(jìn)卵泡的發(fā)育，LH和FSH共同作用于卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞促進(jìn)E2的生成，LH對(duì)排卵和黃體生成也發(fā)揮著重要作用。而卵巢中卵泡分泌的雌激素(E2)和黃體分泌的孕激素(P4)水平變化，會(huì)影響子宮內(nèi)膜和動(dòng)物性行為發(fā)生周期性變化，從而影響動(dòng)情周期及生殖活動(dòng)[15]。Roth Z等研究表明，熱應(yīng)激會(huì)影響卵泡的選擇，降低卵泡液中E2的濃度，抑制卵泡生長(zhǎng)。同時(shí)，熱應(yīng)激可以抑制顆粒細(xì)胞GnRH的表達(dá)并降低生長(zhǎng)卵泡中E2的活性，導(dǎo)致卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡[16]。于楓研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激使小鼠的卵巢和子宮組織發(fā)生壞死，且隨著熱應(yīng)激強(qiáng)度的增強(qiáng)而加劇[17]。高溫會(huì)改變雌性奶牛卵巢中的小腔卵泡，最終影響排卵期卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育能力[4]。在本試驗(yàn)中，兩組小鼠的初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及相應(yīng)的閉鎖卵泡數(shù)目差異不顯著，但是9周齡和12周齡熱應(yīng)激組小鼠次級(jí)卵泡閉鎖率卻顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，初級(jí)卵泡閉鎖率的差異不顯著。這個(gè)結(jié)果暗示，熱應(yīng)激可能通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸，減少促性腺激素的分泌，影響卵泡生長(zhǎng)的環(huán)境，減弱卵泡的發(fā)育能力，尤其是優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育能力，導(dǎo)致卵泡閉鎖率升高。

此外，熱應(yīng)激會(huì)降低血液中GnRH和LH的濃度，導(dǎo)致雌性小鼠發(fā)情周期延長(zhǎng)，影響卵子質(zhì)量[18]，最終會(huì)導(dǎo)致受胎率下降。本實(shí)驗(yàn)中，熱應(yīng)激對(duì)小鼠發(fā)情周期影響不顯著，這可能是因?yàn)樾∈蟮膫€(gè)體差異造成的，后期實(shí)驗(yàn)可以嘗試同發(fā)情后觀察熱應(yīng)激對(duì)小鼠發(fā)情周期的影響。

綜上可知，熱應(yīng)激可抑制雌性小鼠的體重和卵巢重、提高次級(jí)卵泡的閉鎖率，推測(cè)熱應(yīng)激對(duì)雌性小鼠的卵巢發(fā)育有一定的抑制作用，但是熱應(yīng)激調(diào)節(jié)雌性動(dòng)物卵巢發(fā)育的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。