周麗萍，雷 蕾，楚國慶，楊錦亮，李建紅，金建寧

卵巢癌是當(dāng)今社會最常見的病死率很高的惡性腫瘤[1]，因卵巢解剖位置深，故初期起病較隱匿，早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者就診時已到晚期，臨床治療效果及預(yù)后都不甚理想[2-3]。目前，卵巢癌治療方面以手術(shù)及術(shù)后給予順鉑、紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療為主，但患者的5年生存率仍較低[4]，然而紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物作為治療卵巢癌的一線化療藥物，極易產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)率大于50%[5]，且患者生存質(zhì)量差?；诖?，找到有效的抑制卵巢癌耐藥、提高患者生存質(zhì)量的方法具有重要意義。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸聯(lián)合化療藥物比單一運用化療藥物更能提高臨床療效以及患者生活質(zhì)量，但其機制目前尚不明確，故本實驗研究目的旨在為桂枝茯苓丸的臨床運用提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：實驗室所用細(xì)胞為人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：C-0215；桂枝茯苓丸主要組成有桂枝、茯苓、丹皮、芍藥、桃仁，所有生藥購自寧夏明德醫(yī)藥有限公司，采用常規(guī)醇提法煎煮，制備成質(zhì)量濃度9 g/mL,冷卻后儲存至4 ℃冰箱備用。注射用順鉑(凍干型)購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司(批號：601191201)，規(guī)格30 mg，生理鹽水配置成1 mg/ml冷藏備用。

1.1.1 試劑:McCoy,s 5A培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WHO1111806XP)；CLARK胎牛血清(上海慧穎生物科技有限公司，批號：FB25015)；0.25%胰蛋白酶溶解液(北京索萊寶科技有限公司，批號：T1320)；Cleaved-Caspase 3Antibody(Affinity，批號：AF7022)；Cytochrome c Antibody(Affinity，批號：AF0146)；BCL-2 Antibody，(Affinity，批號：AF6139)；β-actin抗體(北京中杉，TA-09)。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑(上海凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.1.2 動物：SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量220～300 g，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。動物許可證號:SCXK(寧)2015-0001，飼養(yǎng)于恒濕、恒溫的籠具中，自由攝入標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料和無菌水。適應(yīng)1周后進(jìn)行試驗。

1.1.3 儀器:CO2培養(yǎng)箱(德國nuaire公司)；蛋白濃度定量儀(Eppendorf公司)；電泳儀(北京六一公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(ATTO公司)；CKX31倒置顯微鏡(日本olympus公司)；TDZ5-WS臺式低速離心機(長沙湘儀儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備：SD大鼠48只，按體重隨機分為4組:生理鹽水組(N組)、桂枝茯苓丸組(中藥組，G組)、順鉑組(DDP組)、桂枝茯苓丸+DDP組(聯(lián)合組，GD組)，每組12只。給藥方式：生理鹽水組給予生理鹽水；桂枝茯苓丸組給予水煎劑，每次2 mL，連續(xù)給藥5 d；DDP組在實驗的第1、3、5 d按所需劑量腹腔注射各1次；聯(lián)合組同時給予桂枝茯苓丸和DDP組的相應(yīng)劑量。各實驗組大鼠在末次給藥2 h 后，心臟取血，靜置1 h，分離血清，同組大鼠所得血清混合以消除個體差異，56 ℃、30 min滅活處理，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后分裝，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：配置含10%的胎牛血清的完全培養(yǎng)基(含1%青霉素、鏈霉素)培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞，孵育于37 ℃、5% CO2和90%濕度的培養(yǎng)箱中，隔日更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿瓶底70%～80% 時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。將細(xì)胞分為對照組、生理鹽水組、DDP組、桂枝茯苓丸組、桂枝茯苓丸+DDP組。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活性：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×103個/mL接種于96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)液，各實驗組分別加入相應(yīng)5%、10%、20%濃度的含藥血清培養(yǎng)液100 μL，對照組為正常培養(yǎng)細(xì)胞，每組設(shè) 3 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。之后每孔加入20 μL MTT，37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩器低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔光密度值(OD值)，并計算生長抑制率：生長抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，計數(shù)后以5×105個/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h 后給藥，各組分別加入相應(yīng)20%濃度的含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后用0.25%的不含EDTA胰酶消化，收集細(xì)胞。離心后用冷PBS液洗滌2次，將細(xì)胞充分混勻，用70%冷乙醇-20 ℃固定24 h。檢測前離心去除乙醇固定液，PBS清洗1次，加入20 μl的RNase酶，37 ℃水浴30 min，再加入500 μl的碘化丙錠(PI)溶液，避光染色30～60 min，400目網(wǎng)過濾后于流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測Bcl-2、Cyt C、Cleaved Caspase 3蛋白水平：將各組刺激細(xì)胞24h后，PBS洗1次，加入細(xì)胞裂解液100 μl，加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解1 h，12 000 r/min離心10 min，取上清液，蛋白定量后，加入2*上樣緩沖液，煮沸5 min，12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，利用Bcl-2、Cyt C、Cleaved Caspase 3特異性抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗檢測，加底物發(fā)光顯影。將膠片掃描后，用TanonGis軟件測定條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組含藥血清對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的影響：見表1。與生理鹽水組相比，DDP組、桂枝茯苓丸組、聯(lián)合組細(xì)胞抑制率均增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；桂枝茯苓丸組、DDP組都可抑制細(xì)胞增殖，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與DDP組、桂枝茯苓丸組相比，聯(lián)合組細(xì)胞抑制率增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同一加藥處理組在相同處理時間的條件下，隨著含藥血清濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相同濃度含藥血清干預(yù)的條件下，同處理組48 h較24 h細(xì)胞抑制率增高；20%濃度的含藥血清處理48h時，對細(xì)胞增殖的抑制率最高。桂枝茯苓丸可抑制人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖活性。

表1 各濃度含藥血清對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 各組含藥血清對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞周期的影響：SKOV-3細(xì)胞處理48h后，與生理鹽水組相比，DDP組、桂枝茯苓丸組、聯(lián)合組G0/G1期比例上升，而S期比例下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。桂枝茯苓丸可能將人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖，見表2。

表2 各組含藥血清對SKOV-3細(xì)胞周期的影響

2.3 各組含藥血清對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞Bcl-2、Cyt C、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響：見表3，DDP組、桂枝茯苓丸組含藥血清可上調(diào)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中Cyt C、Caspase-3蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。與生理鹽水組相比，DDP組、桂枝茯苓丸組、聯(lián)合組SKOV-3細(xì)胞內(nèi)Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與DDP組、桂枝茯苓丸組相比，聯(lián)合組SKOV-3細(xì)胞內(nèi)Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1(封三)。

表3 各組SKOV-3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)情況

3 討論

卵巢癌是女性癌癥死亡的第四大原因[6]。目前，治療卵巢癌常用的方法是手術(shù)及放化療，而對于卵巢癌化療的一線治療方案紫杉醇聯(lián)合卡鉑給患者帶來的毒副作用及耐藥性也成為現(xiàn)在治療卵巢癌需要攻克的一大難題。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在治療腫瘤方面作用凸顯，為治療腫瘤提供了新思路。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的程序性的細(xì)胞死亡，而腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)是細(xì)胞凋亡異常。細(xì)胞凋亡有多個信號途徑調(diào)控，線粒體途徑在細(xì)胞凋亡中起著重要的作用，Bcl-2家族蛋白可調(diào)控線粒體凋亡途徑，Bcl-2屬于抑制細(xì)胞凋亡的抗凋亡蛋白，可調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，誘導(dǎo)促凋亡因子Cyt C的釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。正常情況下，Cyt C存在于線粒體膜間隙中，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號之后，釋放Cyt C至細(xì)胞漿中，在三磷酸脫氧腺苷的參與下與凋亡蛋白酶活化因子結(jié)合，激活Caspase-9及Caspase-3[8]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡最終的執(zhí)行者，其活性對細(xì)胞凋亡有重要意義，且Caspase-3活化過程中可產(chǎn)生活性片段Cleaved-Caspase-3，Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平可反應(yīng)Caspase-3的活性程度和凋亡水平[9-10]。

卵巢癌在中醫(yī)中可歸屬為“積聚”“癥瘕”的范疇。《醫(yī)學(xué)正傳》說明:“積者跡然，挾痰血濃而成形跡，遂郁積久之謂至。”婦女素體虛弱、經(jīng)期受風(fēng)等都可使寒邪積聚，導(dǎo)致氣血運行不暢，最終導(dǎo)致瘀阻胞宮，形成癥瘕[11-12]。總的來說，古代一些醫(yī)家對卵巢癌病因的認(rèn)識主要是血瘀氣滯。桂枝茯苓丸出自張仲景《金匱要略》，方中以桃仁、牡丹皮活血化瘀；配五等量白芍，以養(yǎng)血和血，其次可去瘀養(yǎng)血，使瘀血去而新血生；加入桂枝，既可溫通血脈以助桃仁活血化瘀之力，又可得白芍以調(diào)和氣血；以茯苓之淡滲利濕，寓有濕祛血止之用。綜合全方，主活血散瘀、消癥止血之功?，F(xiàn)代研究證實[13]，桃仁可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用；牡丹皮中有效成分丹皮酚可逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性[14]；白芍有效成分白芍總苷能在不同環(huán)節(jié)對細(xì)胞免疫和體液免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)[15]；桂枝中揮發(fā)油主要成分桂皮醛有抗腫瘤作用[16]；茯苓中主要化學(xué)成分茯苓多糖具有明顯抗腫瘤作用[17]。徐曉焱[18]通過流式細(xì)胞儀檢測到桂枝茯苓丸可使荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，延長其生命周期。楊運高[19]等發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸對腫瘤轉(zhuǎn)移有抑制作用。

本實驗用MTT法觀察了不同濃度桂枝茯苓丸聯(lián)合DDP含藥血清對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖活性的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測20%濃度桂枝茯苓丸聯(lián)合DDP含藥血清對SKOV-3細(xì)胞周期的影響及Western blot檢測Bcl-2、Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)的情況。實驗結(jié)果表明，桂枝茯苓丸聯(lián)合DDP可顯著抑制人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖活性，將SKOV-3細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖；還可上調(diào)Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。表明桂枝茯苓丸聯(lián)合DDP可通過線粒體途徑誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡。