田盼麗，尚 濤，李紅梅

絕經(jīng)后血漿同型半胱氨酸(Hcy)的水平顯著上升，高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個重要的、獨(dú)立的心血管疾病危險(xiǎn)因素，可引起動脈粥樣硬化病變[1-2],但其具體的致病機(jī)制尚未完全明了。本研究探討HHcy是否能通過誘發(fā)脂代謝紊亂及血管的炎性反應(yīng)而發(fā)揮致動脈粥樣硬化作用效應(yīng)，以及葉酸治療是否具有保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：健康4月齡雌性SD大鼠32只，體重(240±20)g，購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(SHAM組)、去卵巢組(OVX組)、蛋氨酸組(MET組)、葉酸治療組(FA組)，各8例。材料：①同型半胱氨酸ELISA試劑盒：上海玉博生物科技有限公司產(chǎn)品，批號：CSB-E08896r；②NF-κB p65單克隆抗體(大鼠)：中山生物工程有限公司產(chǎn)品；③MCP-1單克隆抗體(大鼠)：武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：各組實(shí)驗(yàn)大鼠在無菌條件下行戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后，取下腹正中切口，切除雙側(cè)卵巢，結(jié)扎輸卵管及伴行血管，沖洗閉合傷口。其余8只不切除卵巢，只切除相同大小的卵巢周圍脂肪組織，作為假手術(shù)組。

1.2.2 處理方法：①M(fèi)ET組：去卵巢術(shù)后1周給予蛋氨酸1 g/(kg·d)灌胃;②FA組：去卵巢+蛋氨酸灌胃+葉酸20 mg/(kg·d)腹腔注射，術(shù)后1周SHAM、OVX組灌服蒸餾水，其余各組開始蛋氨酸灌胃，且FA組同時藥物干預(yù)，共持續(xù)9周。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠置同一室內(nèi)，自由飲水，進(jìn)食普通飼料，每周稱重1次，依體重變化調(diào)整給藥劑量。

1.2.3 血清Hcy測定:所有動物術(shù)后10周腹主動脈穿刺取血，分離血清，-20 ℃保存，采用ELISA法測定。檢測方法按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.4 血脂測定:通過生化分析儀測定血清標(biāo)本的血脂水平，主要包括TC、TG、LDL-C、HDL-C。

1.2.5 主動脈形態(tài)學(xué)觀察:所有動物取血后處死，迅速剖取主動脈，將其置于4%多聚甲醛液中常規(guī)固定、石蠟包埋，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切成厚度為5 μm的組織切片，HE染色，光鏡觀察主動脈形態(tài)學(xué)改變。

1.2.6 主動脈NF-κB、MCP-1免疫組化染色:標(biāo)本經(jīng)3% H2O2處理，山羊血清在室溫下封閉20 min，抗NF-κB、抗MCP-1抗體(稀釋度1∶100)和生物素化羊抗兔IgG抗體依次反應(yīng)和洗滌后，以DAB 染色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，切片置于顯微鏡下觀察并照相。

1.2.7 結(jié)果判定及圖像分析:細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒者為陽性，不顯色者為陰性。采用彩色病理圖文分析系統(tǒng)對免疫組化染色片進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清Hcy水平比較：與假手術(shù)組組相比，去卵巢術(shù)后大鼠血清tHcy濃度明顯升高(P<0.05)；給予蛋氨酸負(fù)荷，去勢大鼠的血清tHcy濃度進(jìn)一步升高(P<0.05)；葉酸治療可顯著降低血清tHcy濃度(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清Hcy水平及主動脈NF-κB、MCP-1表達(dá)的比較

2.2 各組大鼠血脂水平比較：與SHAM組相比，OVX、MET組血清TC、LDL-C濃度明顯升高(P<0.05)，HDL-C濃度降低(P<0.05，)；與MET組相比，F(xiàn)A組血清TC、LDL-C濃度均明顯降低(P<0.05)，HDL-C濃度均明顯升高(P<0.05)，接近SHAM組水平(P>0.05)；各組TG均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的比較

2.3 HE染色結(jié)果:通過HE染色，在光鏡可見假手術(shù)組主動脈內(nèi)膜光滑完整，單層內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，無脂質(zhì)條紋或纖維斑塊。去卵巢組主動脈內(nèi)膜明顯增厚，可見泡沫細(xì)胞，蛋氨酸負(fù)荷組內(nèi)皮細(xì)胞廣泛損傷，出現(xiàn)鈣化壞死區(qū)。藥物治療組均不同程度地改善了血管的病理改變(圖1-圖4，目錄后)。

2.4 主動脈NF-κB、MCP-1免疫組化結(jié)果：OVX、MET組大鼠主動脈組織NF-κB、MCP-1的表達(dá)較SHAM組明顯升高(P<0.05)；MET組NF-κB、MCP-1的表達(dá)較OVX組進(jìn)一步升高(P<0.05)；而葉酸治療能減少蛋氨酸負(fù)荷去勢大鼠誘導(dǎo)的HHcy所致的主動脈組織NF-κB、MCP-1的表達(dá)。

3 討論

絕經(jīng)后，除人們所熟知的激素水平的改變外，血漿同型半胱氨酸的水平也顯著上升[1-2]，SHAONAN高奮[3-4]等實(shí)驗(yàn)均證明蛋氨酸負(fù)荷飲食亦可建立高同型半胱氨酸血癥動物模型。去卵巢大鼠經(jīng)蛋氨酸負(fù)荷后，蛋氨酸在體內(nèi)可代謝為同型半胱氨酸而進(jìn)一步加重高同型半胱氨酸血癥(HHcy)[3]，HHcy是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個重要的、獨(dú)立的心血管疾病危險(xiǎn)因素，可引起動脈粥樣硬化病變[5-6]。本研究結(jié)果表明，OVX組大鼠血漿tHcy濃度較SHAM組升高，MET組血漿tHcy濃度較OVX組進(jìn)一步升高，從而證明蛋氨酸負(fù)荷會加重去卵巢大鼠的高同型半胱氨酸血癥，葉酸能顯著降低OVX、MET組大鼠血漿tHcy水平。

眾所周知，脂代謝異常是動脈粥樣硬化和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。高同型半胱氨酸血癥影響血管內(nèi)皮細(xì)胞膽固醇的代謝，使血管內(nèi)皮細(xì)胞羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，引起脂代謝紊亂。高脂血癥通過脂毒性損傷內(nèi)皮細(xì)胞，受損的內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子和黏附分子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子等來調(diào)節(jié)單核細(xì)胞黏附和遷移，單核細(xì)胞黏附于血管 EC 并進(jìn)一步遷移進(jìn)入血管壁，攝取脂質(zhì)(OX-LDL、OX-VLDL)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞增加是AS形成早期的重要事件，在 AS 的形成中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OVX、MET組血清TC、LDL-C明顯升高，而HDL-C明顯降低，經(jīng)相關(guān)分析表明，OVX、MET組大鼠血清Hcy濃度與血清TC、LDL-C呈正相關(guān)(r=0.295、0.367，P<0.05)，說明高同型半胱氨酸血癥可引起脂代謝紊亂，促進(jìn)心血管損害發(fā)生。

炎性反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。外周血單核細(xì)胞遷入動脈內(nèi)皮下間隙，分化為巨噬細(xì)胞是動脈粥樣硬化的最早事件，而炎性細(xì)胞的召集、浸潤主要由細(xì)胞趨化因子MCP-1調(diào)節(jié)。動脈組織可誘導(dǎo)表達(dá)NF-κB 和MCP-1，NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)的多效炎性核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控下游靶基因MCP-1的表達(dá)，MCP-1作為單核/巨噬細(xì)胞特異性的趨化因子，可引起單核/巨噬細(xì)胞在主動脈組織中廣泛浸潤，與泡沫細(xì)胞、粥樣斑塊的形成密切相關(guān)。目前，高濃度Hcy促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤、巨噬細(xì)胞聚積主要是通過NF-κB途徑誘導(dǎo)的MCP-1活化而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測大鼠主動脈組織NF-κB、MCP-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX、MET組大鼠主動脈NF-κB、MCP-1的表達(dá)均明顯增多，即蛋氨酸負(fù)荷去勢大鼠促進(jìn)NF-κB、MCP-1的表達(dá)，且MCP-1隨著NF-κB表達(dá)的增多而增多，亦說明NF-κB調(diào)控MCP-1的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中這種機(jī)制呈過度活化作用，并且這種調(diào)控作用本身可能參與了AS的發(fā)生和發(fā)展。

同型半胱氨酸是一種含硫非必需氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物。葉酸及其相關(guān)的輔酶因參與Hcy再甲基化生成蛋氨酸的代謝，被認(rèn)為補(bǔ)充葉酸等B族維生素可降低血漿同型半胱氨酸水平[7-8]。Sharma M等[3]利用去卵巢大鼠模型，觀察高同型半胱氨酸血癥與心血管病的關(guān)系，及激素替代療法和葉酸干預(yù)對心血管病的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清中低水平的葉酸含量與高水平的tHcy相關(guān)，單用葉酸或與激素替代療法聯(lián)合應(yīng)用，對大鼠OVX組雌激素水平下降所致的相關(guān)癥狀產(chǎn)生保護(hù)作用。Cui R等[9]研究葉酸治療顯著降低大鼠血漿tHcy水平，葉酸可能通過下調(diào)趨化因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來阻止HHcy誘導(dǎo)的早期動脈粥樣硬化的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，蛋氨酸負(fù)荷的去卵巢大鼠給予葉酸干預(yù)治療9周后，F(xiàn)A組血漿tHcy均顯著低于MET組大鼠，但仍高于SHAM組和OVX組大鼠，這與葉酸參與同型半胱氨酸代謝有關(guān)。由此說明，葉酸干預(yù)治療可降低蛋氨酸負(fù)荷去卵巢大鼠Hcy水平，從而減輕高同型半胱氨酸血癥對心血管損害的影響，本研究結(jié)果與李剛[10]研究結(jié)論一致，說明葉酸輔助療法能有效改善伴高Hcy血癥高血壓患者頸動脈硬化情況。

葉酸在顯著降低血漿Hcy水平的同時，能不同程度地降低TC、LDL-C濃度，升高HDL-C濃度，改善脂代謝紊亂；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葉酸可抑制蛋氨酸負(fù)荷的去勢大鼠主動脈NF-κB、MCP-1的表達(dá)，減輕HHcy引起的血管炎性損害。因此葉酸除了具有抗氧化及降低血漿Hcy水平外，其對細(xì)胞炎性因子表達(dá)的抑制證實(shí)其具有抗炎作用，這可能為臨床治療HHcy所致的動脈粥樣硬化提供動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為動脈粥樣硬化的防治提供了一個新思路。