仇菊萍，劉學(xué)燕

腎臟是糖尿病進(jìn)展后主要累及器官，糖尿病腎病的發(fā)生將顯著增加患者病死率[1]。因而，早期對(duì)糖尿病患者進(jìn)行腎功能監(jiān)測(cè)，并有針對(duì)性地給予保護(hù)性干預(yù)對(duì)阻斷病情，改善患者預(yù)后具有積極作用[2]。1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]是維生素D的活化形式，既往已有報(bào)道顯示1,25-(OH)2D3具有抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用[3-4]，且對(duì)腎臟可發(fā)揮保護(hù)功能，但目前有關(guān)其具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究建立糖尿病大鼠模型，并觀察1,25-(OH)2D3對(duì)腎組織P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響，以探討其療效及其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選用84只清潔級(jí)健康大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，周齡5～7周；體重(180.54±35.96)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所提供，所有動(dòng)物均為雄性。

1.2 動(dòng)物分組與建模：采用隨機(jī)數(shù)字表法將84只大鼠分為A、B、C 3組，每組各28只。A組采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，常規(guī)飼料均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，連續(xù)喂養(yǎng)6周。B、C組給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)6周，飼料配方：67%常規(guī)飼料+20%蔗糖+10%煉豬油+2%膽固醇+1%膽鹽。經(jīng)尾靜脈采血，檢測(cè)血糖值，以血糖>16.7 mmol/L提示糖尿病大鼠建模成功[5]。建模成功后A組繼續(xù)給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，B、C組給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)，同時(shí)B組給予1,25-(OH)2D3腹腔注射，5 μg/kg，隔日注射1次，注射部位選擇在下腹腹白線左側(cè)0.5 cm處，共7次。注射完成2周后處死大鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)室方法：分別在喂養(yǎng)開(kāi)始時(shí)(T1)、建模成功時(shí)(T2)及1,25-(OH)2D3干預(yù)完成后2周時(shí)(T3)經(jīng)大鼠尾靜脈采血，離心取上清液送檢。采用免疫比濁法檢測(cè)血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)，計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)=Ucr/Scr×每分鐘尿量。采用Ichem-520型全自動(dòng)血液生化分析儀(深圳庫(kù)貝爾生物科技有限公司提供)檢測(cè)血尿素氮(BUN)和胱抑素C(Cys-C)水平。

在處死大鼠后摘取腎臟，取1.5 mm×1 mm×1 mm標(biāo)本進(jìn)行石蠟切片，采用免疫組化染色，以0.3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后滴加一抗，4 ℃過(guò)夜，37 ℃孵育1.0 h，PBS沖洗后滴加二抗。一抗為P38MAPK多克隆抗體和TGF-β1多克隆抗體，二抗為山羊抗兔IgG。在顯微鏡下顯色，復(fù)染。取高倍鏡視野記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與染色情況。以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與染色評(píng)分相加≥2分結(jié)果為陽(yáng)性，2分≤評(píng)分≤3分為(+)，3分<評(píng)分≤5分為(++)，評(píng)分>5分為(+++)。取腎組織1.5 mm×1 mm×1 mm作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，提取標(biāo)本總蛋白，采用Western bolt法檢測(cè)腎組織P38MAPK與TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜處理，以β-actin蛋白作為內(nèi)參照，以光密度值(OD)目的蛋白與OD β-actin蛋白比值為P38MAPK與TGF-β1相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠腎功能指標(biāo)比較：3組大鼠T2和T3時(shí)Ccr、BUN及Cys-C水平差異顯著，其中T2時(shí)B、C 2組Ccr、BUN及Cys-C水平顯著高于A組(P<0.05)，T3時(shí)B組Ccr、BUN及Cys-C顯著低于C組，高于A組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠腎功能指標(biāo)比較

2.2 3組大鼠P38MAPK與TGF-β1比較：3組大鼠腎組織P38MAPK與TGF-β1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖1-圖4(封三)。

表2 3組大鼠P38MAPK與TGF-β1比較 [n(%)]

2.3 3組大鼠P38MAPK與TGF-β1蛋白表達(dá)：3組大鼠腎組織P38MAPK與TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組大鼠P38MAPK與TGF-β1顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。3組大鼠腎組織P38MAPK與TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)性(r=0.418，P<0.05)。

表3 3組大鼠P38MAPK與TGF-β1蛋白表達(dá)

3 討論

1,25-(OH)2D3是具有上調(diào)抗菌肽、抑制炎癥反應(yīng)作用的免疫調(diào)節(jié)劑，既往報(bào)道證實(shí)1,25-(OH)2D3能調(diào)節(jié)鈣磷代謝[6-7]，這對(duì)于改善腎小管重吸收作用，減少鈣磷排出具有重要意義。Huhtakangas J A等[8]研究也顯示1,25-(OH)2D3可調(diào)節(jié)大鼠腎臟組織細(xì)胞和血管生長(zhǎng)因子表達(dá)，達(dá)到減輕蛋白尿，保護(hù)腎功能的目的。Ccr能客觀反映腎小球?yàn)V過(guò)功能，Cys-C是經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)的小分子量蛋白，報(bào)道還證實(shí)Ccr與Cys-C具有良好的相關(guān)性，與腎功能損傷程度密切相關(guān)[9-10]。本研究設(shè)計(jì)糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示1,25-(OH)2D3干預(yù)能顯著改善糖尿病大鼠Ccr與Cys-C水平，保護(hù)腎功能，證實(shí)了既往結(jié)論。

炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病腎病發(fā)病的關(guān)鍵因素，TGF-β1等炎性因子過(guò)度表達(dá)，可促進(jìn)腎臟結(jié)締組織增生和熱休克蛋白[11-12]，進(jìn)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展。Zhang L等[13]還認(rèn)為T(mén)GF-β1活化在糖尿病累及腎臟過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。而P38MAPK是MAPK家族重要成員，既往研究認(rèn)為P38MAPK參與細(xì)胞分化、增殖及凋亡過(guò)程[14]，曹少祥等[15]發(fā)現(xiàn)P38MAPK可誘導(dǎo)bcl-2和caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。鄭嫵媚等[16]研究則顯示P38MAPK可調(diào)控NF-kB等核轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3干預(yù)后B組P38MAPK與TGF-β1顯著低于C組，提示1，25-(OH)2D3能調(diào)節(jié)P38MAPK與TGF-β1水平，且P38MAPK與TGF-β1具有相關(guān)性，提示P38MAPK可作為T(mén)GF-β1下游信號(hào)通路,促進(jìn)糖尿病腎病病理進(jìn)展。而1,25-(OH)2D3干預(yù)可能通過(guò)抑制TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控P38MAPK介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，減輕腎損傷。另外，P38MAPK可作為T(mén)GF-β1上游信號(hào)通路[17-18]，二者相互影響，在1,25-(OH)2D3干預(yù)后抑制TGF-β1與P38MAPK信號(hào)通路，這可能是其發(fā)揮保護(hù)腎功能作用機(jī)制之一。