瞿根義，王佳威，徐 勇，陽 光，聶海波，黃文琳，湯 乘

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院泌尿外科，湖南株洲 412007)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一種異源性疾病，由透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)和非透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(non-clear cell renal cell carcinoma，nccRCC)組成[1]。嫌色細(xì)胞癌(chromophobe renal cell carcinoma，chRCC)，則是nccRCC第二常見的亞型，約占腎細(xì)胞癌亞型的4%～5%[2]，發(fā)病年齡多為50～60歲，男女發(fā)病率無明顯差異[3]。雖然有研究表明具有局部chRCC和ccRCC的患者在5年生存率方面無顯著性差異(P=0.98)[4]，但是大部分chRCC的患者預(yù)后比其他類型的RCC患者好，通常采取手術(shù)切除治療即可達(dá)到滿意的效果。然而對(duì)于部分進(jìn)展期、預(yù)后差的患者，往往需要免疫治療和分子靶向治療等輔助治療。目前，治療chRCC的靶向藥物療效不是十分明確，藥物依舊處在臨床試驗(yàn)階段，需要長(zhǎng)時(shí)間的觀測(cè)[5]。因此進(jìn)一步研究chRCC發(fā)病的相關(guān)基因，將有助于了解chRCC的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展，并對(duì)尋找更加安全有效的治療措施有著舉足輕重的作用。

TCGA數(shù)據(jù)庫作為當(dāng)前世界上最大的腫瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，具有大樣本和豐富臨床數(shù)據(jù)的優(yōu)勢(shì)。生物信息學(xué)則是將分子生物學(xué)和電子計(jì)算機(jī)相結(jié)合的技術(shù)，可以為基因的研究提供明確的方向，幫助揭示大量生物信息中所含的奧秘。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)腎嫌色細(xì)胞癌的發(fā)病相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整合和分析，篩選出差異基因，并進(jìn)行基因富集(gene ontology，GO)分析和KEGG通路富集分析，制作PPI互作網(wǎng)絡(luò)，以求尋找腎嫌色細(xì)胞癌發(fā)病及發(fā)展的關(guān)鍵基因，最終對(duì)挖掘到的關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析，為進(jìn)一步研究腎嫌色細(xì)胞癌的研究機(jī)制奠定生物基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料在TCGA Datasets(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫中以“chromophobe renal cell carcinoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，并下載公開的關(guān)于腎嫌色細(xì)胞癌的基因組數(shù)據(jù)，下載的基因組數(shù)據(jù)格式為FPKM。通過下載的基因組數(shù)據(jù)獲取臨床樣本量共89例，其中腎嫌色細(xì)胞癌樣本65例，正常組織24例。

1.2 方法

1.2.1獲取差異基因 應(yīng)用R軟件中的edgeR算法對(duì)腎嫌色細(xì)胞癌的數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異表達(dá)分析，根據(jù)差異倍數(shù)(log2)絕對(duì)值>2.5和FDR調(diào)整后P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因1 850個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因760個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因1 090個(gè)。并利用ggplot2軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形可視化。

1.2.2差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫(DAVID；https：//david.ncifcrf.gov)對(duì)篩選的顯著差異基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異，應(yīng)用R軟件及相應(yīng)的clusterProfiler包進(jìn)行注釋及可視化。

1.2.3Hub基因的篩選 STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)用于識(shí)別己知和預(yù)測(cè)蛋白與蛋白之間的相互作用[6-7]。使用STRING對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析并構(gòu)建蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件從STRING構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選獲取前10位Hub基因。

1.2.4對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析 利用R軟件對(duì)篩選獲取的關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析，并構(gòu)建Kaplan-Meier生存曲線，從而判斷關(guān)鍵基因與腎嫌色細(xì)胞癌預(yù)后關(guān)系。使用Log-rank檢驗(yàn)評(píng)估關(guān)鍵基因的表達(dá)水平與腎嫌色細(xì)胞癌患者總生存率之間的生存差異，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因篩選該研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載、整理及分析了89例腎嫌色細(xì)胞癌患者的數(shù)據(jù)，其中包含65個(gè)腎嫌色細(xì)胞癌樣本和24個(gè)正常樣本，利用R語言軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，以P<0.05且差異倍數(shù)2.5倍為顯著差異獲取差異表達(dá)基因。共篩選出腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因1 850個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因760個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因1 090個(gè)，并繪制火山圖(圖1)和差異最顯著的前50個(gè)基因熱圖(圖2)。

紅點(diǎn)：基于logFC>2.5且P<0.05篩選的下調(diào)基因；綠點(diǎn)：基于logFC<-2.5且P<0.05篩選的下調(diào)基因；黑點(diǎn)：沒有顯著差異的基因；FOR：差異倍數(shù)。

2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果通過GO富集分析和KEGG通路富集分析篩選的差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，在GO富集分析中包括生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cell composition，CC)和分子功能(molecular function，MF)，在BP中差異基因主要富集于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、化學(xué)突觸傳遞、膜電位調(diào)節(jié)和消化排泄，在CC中差異基因主要富集于質(zhì)膜的組成部分、質(zhì)膜、頂質(zhì)膜和細(xì)胞外區(qū)域，在MF中差異基因主要富集于激素活性、氧化還原酶活性和鈣離子結(jié)合，在KEGG通路分析中主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、視黃醇代謝、類固醇激素的合成。主要富集結(jié)果見表1、表2和圖3。

圖2 腎嫌色細(xì)胞癌及癌旁正常組織差異表達(dá)最顯著的前50個(gè)基因熱圖

表1 腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果

表2 腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析結(jié)果

A：差異基因GO富集可視化；B：差異基因KEGG通路富集可視化。

2.3 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果通過STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)腎母細(xì)胞瘤發(fā)病的差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape軟件中Cytohubba篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的連接程度前10位Hub基因(圖4)，分別是：KNG1、AGT、CASR、SST、AGTR2、PMCH、GNG4、DRD2、MCHR2、SSTR3。

2.4 關(guān)鍵基因的生存分析對(duì)排名前10位的Hub基因進(jìn)行生存分析，構(gòu)建出Kaplan-Meier生存曲線，發(fā)現(xiàn)只有MCHR2的表達(dá)對(duì)腎嫌色細(xì)胞癌患者的總生存率(overall survival，OS)影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余基因的表達(dá)水平都與腎嫌色細(xì)胞癌無顯著相關(guān)性。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的10 Hub基因

A：KNG1；B：AGT；C：CASR；D：SST；E：AGTR2；F：PMCH；G：GNG4；H：DRD2；I：MCHR2；J：SSTR3。

3 討 論

腎嫌色細(xì)胞癌是起源于腎小管集合上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，雖然臨床上不常見，但是在nccRCC中，其發(fā)病率僅次于乳頭狀腺癌[8]。雖然chRCC少見且為低度惡性潛能的腫瘤，但是仍有部分預(yù)后差、進(jìn)展期的患者需要輔助治療。因此將chRCC各個(gè)時(shí)期與環(huán)節(jié)中共同表達(dá)的相關(guān)基因進(jìn)行深入研究，挖掘出疾病發(fā)生與發(fā)展中起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因，對(duì)了解疾病的機(jī)制、改進(jìn)疾病的治療措施以及相應(yīng)靶向藥物的研發(fā)十分重要。

本研究致力于篩選并分析與腎嫌色細(xì)胞癌發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫檢索篩選共挖掘出腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因1 850個(gè)，其中包括了表達(dá)上調(diào)基因760個(gè)和表達(dá)下調(diào)基因1 090個(gè)。通過GO富集分析和KEGG富集分析來篩選與分析差異表達(dá)基因，最終得到各個(gè)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。在BP中差異基因主要富集于細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、化學(xué)突觸傳遞、膜電位調(diào)節(jié)等。在CC中差異基因富集于細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜。在MF中差異基因主要富集于氧化還原酶活性、鈣離子結(jié)合、K離子通道等。在KEGG通路分析中主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、視黃醇代謝、類固醇激素的合成。隨后進(jìn)一步通過STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白調(diào)節(jié)點(diǎn)主要集中在KNG1、AGT、CASR、SST、AGTR2、PMCH、GNG4、DRD2、MCHR2、SSTR3。

激肽原(Kininogen 1，KNG1)重組蛋白參與機(jī)體各種生理活動(dòng)，例如控制血管的擴(kuò)張、維持水電解質(zhì)的平衡以及調(diào)控細(xì)胞的凋亡等[9]。如今越來越多的證據(jù)表明KNG1似乎具有抗血管生成的功能，并能阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在癌癥的發(fā)生起到一定的作用[10]。此外還有研究表明，在癌癥患者的血清中檢測(cè)到KNG1基因的低表達(dá)，因此KNG1可以作為癌癥和晚期大腸腺瘤的潛在血清預(yù)測(cè)因子[11]。編碼血管緊張素原的AGT則可以抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，因?yàn)橛醒芯恳炎C實(shí)AGT能夠獨(dú)立于血管緊張素Ⅱ在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生非常強(qiáng)大的抗血管生成作用[12]，實(shí)驗(yàn)中AGT的過度表達(dá)能明顯降低腫瘤內(nèi)新生血管的形成，從而延緩了腫瘤的發(fā)展[13]，這代表了AGT有望成為抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的新的研究方向。CASR基因在人體腎臟組織中廣泛表達(dá)，對(duì)維持人體健康組織的鈣穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[14]。最近一項(xiàng)研究證明，在腎部分切除術(shù)后5年內(nèi)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞標(biāo)本中，CASR的表達(dá)最高[15]。研究也指出CASR的過度表達(dá)可能誘導(dǎo)RCC癌細(xì)胞的增殖潛能以及癌細(xì)胞的鈣依賴性粘附，從而增加骨轉(zhuǎn)移的概率[16]。此外，DRD2缺失也與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[17]，大量研究顯示DRD2與結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞癌和胃癌的發(fā)病皆有關(guān)聯(lián)。這是因?yàn)镈RD2具有遺傳多態(tài)性，這種多態(tài)性與細(xì)胞mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯的改變有關(guān)[18]，DRD2密度的降低會(huì)減少對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制及改變細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的癌變，增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。MCHR2是黑色素濃縮激素(Modifier of chinchilla，MCH)的受體之一，該基因位于人類第6號(hào)染色體長(zhǎng)臂上[19]。本研究發(fā)現(xiàn)MCHR2是唯一與腎嫌色細(xì)胞癌患者的OS有顯著相關(guān)性的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)MCHR2和肥胖癥密切相關(guān)，MCHR2受到MCH的激活后調(diào)節(jié)下丘腦的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器，從而控制機(jī)體的飲食行為和能量消耗[20]，特別是非典型抑郁癥患者M(jìn)CHR2基因的變異是其BMI升高的危險(xiǎn)因素之一[21]。在腫瘤中尚無MCHR2基因的研究，本研究顯示MCHR2與腎嫌色細(xì)胞癌預(yù)后顯著相關(guān)，因此MCHR2可作為腎嫌色細(xì)胞癌研究的新方向。

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出了與chRCC疾病發(fā)生與發(fā)展相關(guān)的基因，并挖掘及討論與腎嫌色細(xì)胞癌相關(guān)的關(guān)鍵基因。MCHR2有可能成為腎嫌色細(xì)胞癌潛在的治療靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物。但是，由于與腎嫌色細(xì)胞癌相關(guān)的基因?qū)用娴难芯咳匀狈?，因此還需要大量的研究來闡明這些基因在腎嫌色細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)功能，并為腎嫌色細(xì)胞癌的治療提供新的線索和方向。