邵鑫 蔣先虹 王瑞 蒲強紅 韓彬 劉福

摘 要 目的：研究紫草素對人結(jié)腸癌細胞HCT116自噬和凋亡的影響。方法：以0（空白對照）、10、20、40 μg/mL紫草素作用于HCT116細胞48 h后，采用MTT法檢測細胞增殖抑制率;采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率;分別采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法和Western blotting法檢測細胞中微管相關(guān)蛋白輕鏈 3（LC3）和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p62的mRNA及其蛋白表達水平。結(jié)果：與空白對照比較，10、20、40 μg/mL紫草素作用48 h后HCT116細胞的增殖抑制率和凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。10、20、40 μg/mL紫草素作用于HCT116細胞48 h后均可不同程度地升高細胞中LC3、Beclin-1、p62 mRNA及其蛋白的表達水平，除10 μg/mL紫草素作用后細胞中LC3 mRNA表達水平升高不顯著外，其余指標水平與空白對照比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：紫草素可誘導人結(jié)腸癌細胞HCT116發(fā)生凋亡，并激活其自噬途徑。

關(guān)鍵詞 紫草素;人結(jié)腸癌細胞HCT116;自噬;凋亡

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of shikonin on autophagy and apoptosis of human colon cancer HCT116 cells. METHODS： After treating HCT116 cells for 48 h with shikonin at 0 （blank control） 10， 20， 40 μg/mL， MTT method was used to detect inhibitory rate of cell proliferation. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate. RT-qPCR assay and Western blotting were respectively used to detect mRNA and protein expressions of microtubule associated protein light chain 3 （LC3） and autophagy-related protein Beclin-1 and p62. RESULTS： Compared with blank control， after treated with 10， 20， 40 μg/mL shikonin for 48 h， proliferation inhibitory rate and apoptosis rate of HCT116 cells were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with 10， 20， 40 μg/mL shikonin for 48 h， mRNA and protein expressions of LC3， Beclin-1 and p62 in HCT116 cells were increased to different extents; except that mRNA ?expression of LC3 was not increased significantly after treated with 10 μg/mL shikonin， the difference were statistically significant in other indexes， compared with blank control （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Shikonin can induce the apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and activate its autophagy pathway.

KEYWORDS Shikonin; Human colon cancer HCT116 cells; Autophagy; Apoptosis

結(jié)腸癌是全世界發(fā)病率和病死率均位居前列的癌癥之一，可能由多種危險因素引起，且其病死率呈逐年上升趨勢[1-2]。目前，化療仍是結(jié)腸癌治療的主要手段之一，但化療藥物具有較大的毒副作用[3-4]，且患者5年生存率僅為42.7%[5]。因此，高效、低毒的新型天然抗結(jié)腸癌藥物越來越受到人們的關(guān)注[6]。近年來，天然藥物已顯示出對多種癌癥的治療前景，因其化學及生物活性多樣、毒性低以及具有調(diào)節(jié)各種信號轉(zhuǎn)導途徑和細胞過程的能力而在癌癥治療方面受到重視[3]。

紫草素是一種來自天然植物藥紫草的萘醌類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[7]。研究表明，紫草素對神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞具有廣泛的抑制作用[8-10]，有可能開發(fā)成為一種新的高效、低毒的抗癌藥物。目前，細胞自噬與凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注，自噬誘導的細胞死亡可能抑制腫瘤細胞的生長，從而抑制腫瘤的發(fā)生[11]。因此，本研究以人結(jié)腸癌細胞HCT116為研究對象，研究紫草素對其自噬和凋亡的影響，初步探討紫草素抗結(jié)腸癌的作用機制，從而為該藥的開發(fā)及結(jié)腸癌的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HF90型CO2培養(yǎng)箱（上海力新儀器有限公司）;M200 PRO全波長全自動酶標儀（瑞士Tecan公司）;BDFACS Aria Ⅲ型流式細胞儀（美國BD公司）;Light Cycler 96 型實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）儀（瑞士Roche公司）;INFINITY 3026型凝膠成像系統(tǒng)（法國Vilber Lourmat公司）;Pultton P200+型紫外分光光度計（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

紫草素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0769-9903，純度：≥98.0%）;胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶（美國Gibco公司）;Trizol試劑（北京索萊寶科技有限公司）;MTT試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司，批號：KGA105-KGA108）;鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈 3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）單克隆抗體、兔抗人自噬相關(guān)蛋白Beclin-1單克隆抗體、兔抗人自噬相關(guān)蛋白p62單克隆抗體（美國CST公司，批號：3700S、12741S、3495S、23214S）;RPMI 1640培養(yǎng)基、青-鏈霉素（美國Hyclone公司）;辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗（成都正能生物技術(shù)有限責任公司，批號：511103、511203）;Transcription Kit Quanti Nova逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen公司）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）;RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）;ECL化學發(fā)光液（合肥Biosharp生物公司）;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司）;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為蒸餾水。

1.3 細胞株

人結(jié)腸癌細胞株HCT116 購自中國醫(yī)學科學院細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及樣品溶液制備

將HCT116 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，將細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2～3 d，待細胞融合度至80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。本研究選用傳代10～20代的HCT116細胞進行試驗。將50 μg紫草素溶解于50 μL的DMSO中，制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液，分裝后凍存于-20 ℃冰箱中，備用。使用時，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將母液分別稀釋為10、20、40 μg/mL的樣品溶液。

2.2 紫草素對HCT116細胞增殖的影響考察

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的HCT116細胞，接種于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，將細胞接種至96孔板中，每孔100 μL。將細胞分為空白對照組（0 μg/mL）和紫草素低、中、高質(zhì)量濃度組（10、20、40 μg/mL），并設(shè)置不加細胞的陰性對照組，每組均設(shè)置3個復孔。每孔接種100 μL藥液（各給藥組）或RPMI 1640培養(yǎng)基（空白對照組和陰性對照組），每孔中DMSO的終濃度均為1%。培養(yǎng)48 h后，每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，將細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h;吸棄培養(yǎng)液，每孔中加入DMSO溶液100 μL，溶解沉淀，繼續(xù)培養(yǎng)10 min。采用酶標儀檢測各孔在570 nm波長處的光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）=[1-（陰性對照組OD值-加藥組細胞OD值）/（陰性對照組細胞OD值-空白對照組細胞OD值）]×100%。試驗重復3次。

2.3 紫草素對HCT116細胞凋亡的影響考察

采用流式細胞儀檢測。取對數(shù)生長期HCT116細胞，處理、接種、分組、給藥方法均同“2.2”項下，每組均設(shè)置3個復孔。培養(yǎng)48 h后，用胰酶消化并收集細胞，以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后，將細胞重懸于Loading buffer緩沖液中，分別加入5 μL的 Annexin Ⅴ-FITC染色液和5 μL的PI染色液，避光孵育15 min，所有操作均在冰上進行。采用流式細胞儀在1 h內(nèi)對染色細胞進行檢測，并用FlowJo V10軟件測定細胞凋亡率。試驗重復3次。

2.4 紫草素對HCT116細胞自噬相關(guān)基因mRNA表達的影響考察

采用RT-qPCR法檢測。取對數(shù)生長期HCT116細胞，接種于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，然后接種至6孔板中，每孔2 mL。細胞分組和給藥方法同“2.2”項下，每組均設(shè)置3個復孔。培養(yǎng)48 h后，用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，采用紫外分光光度法檢測RNA濃度及純度后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進行PCR擴增。反應體系（共20 μL）：cDNA模板2 μL，Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。擴增條件：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各目標基因mRNA的表達水平。試驗重復3次。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.5 紫草素對HCT116細胞中自噬相關(guān)蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期的HCT116細胞，接種、分組、給藥方法均同“2.4”項下，每組均設(shè)置3個復孔。培養(yǎng)48 h后，用RIPA裂解液充分裂解細胞并提取細胞中總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，然后行變性處理后取蛋白50 μg在80 V電壓下行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）150 min，再以電流200 mA濕法轉(zhuǎn)膜80 min至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉進行常溫封閉1 h;加入β-actin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p62一抗（稀釋度均為 ? 1 ∶ ?1 000），4 ℃下孵育過夜;以PBST緩沖液洗膜3次，然后加入相應二抗（稀釋度均為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;以PBST緩沖液洗膜3次，然后在凝膠成像系統(tǒng)中采用ECL化學發(fā)光液顯色。采用Image J 1.52a軟件對蛋白條帶進行分析，以Beclin-1、p62蛋白條帶與內(nèi)參β-actin蛋白條帶的灰度值之比表示Beclin-1、p62蛋白的表達水平，以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的灰度值之比表示LC3蛋白的表達水平。試驗重復3次。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 紫草素對HCT116細胞增殖的影響

與空白對照組（細胞增殖抑制率計為0）比較，紫草素低、中、高質(zhì)量濃度組細胞的增殖抑制率[依次為（30.76±5.57）%、（43.02±7.11）%、（68.18±9.29）%]均顯著升高（P<0.05），并具有一定的濃度依賴性趨勢。

3.2 紫草素對HCT116細胞凋亡的影響

與空白對照組比較，紫草素低、中、高質(zhì)量濃度組細胞的凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），并具有一定的濃度依賴性趨勢。各組細胞凋亡情況的流式細胞圖見圖1，凋亡率測定結(jié)果見表2。

3.3 紫草素對HCT116細胞中自噬相關(guān)基因mRNA表達的影響

與空白對照組比較，紫草素中、高質(zhì)量濃度組細胞中LC3 mRNA表達水平和紫草素低、中、高質(zhì)量濃度組細胞中Beclin-1 mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），紫草素低、中、高質(zhì)量濃度組細胞中p62 mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中LC3、Beclin-1和p62 mRNA表達水平測定結(jié)果見表3。

3.4 紫草素對HCT116細胞中自噬相關(guān)蛋白表達的影響

與空白對照組比較，紫草素低、中、高質(zhì)量濃度組細胞中LC3和Beclin-1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），p62蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中LC3、Beclin-1和p62蛋白表達的電泳圖見圖2，表達水平測定結(jié)果見表4。

4 討論

結(jié)腸癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)腸癌是導致癌癥死亡的第四大原因[12]。目前認為癌癥的發(fā)生與腫瘤細胞凋亡及自噬的異常存在密切關(guān)系：細胞凋亡是依賴于凋亡基因及其編碼的蛋白所調(diào)控的Ⅰ型程序性死亡，對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和平衡具有重要作用;細胞自噬被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是依賴溶酶體降解細胞質(zhì)內(nèi)細胞器和大分子物質(zhì)的代謝途徑[13-15]。近年來研究證明，自噬可作為腫瘤細胞的保護機制，在饑餓或藥物刺激時腫瘤細胞會迅速提高自身自噬水平，來提供自身所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和能量[16-17]。但是，過度的自噬也會抑制腫瘤細胞生長，致使細胞發(fā)生自噬性死亡[16-17]。細胞凋亡與自噬功能的異常與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展也具有密切關(guān)系[18]。手術(shù)加化療是目前治療結(jié)腸癌的常用方法，而惡性腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受性是導致治療進程受阻的主要原因。由于中國傳統(tǒng)中藥具有多靶點、多成分的特性，因此在惡性腫瘤治療方面逐漸受到關(guān)注[19]。紫草素目前已顯示出了多種抗腫瘤活性，可能是潛在的有效藥物[9]。

本課題組前期首先通過初步的MTT試驗進行抗腫瘤活性篩選，計算出紫草素對HCT116細胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）約為20 μg/mL。故在本研究中采用IC50作為中質(zhì)量濃度（20 μg/mL）、1/2的IC50作為低質(zhì)量濃度（10 μg/mL）、2倍IC50作為高質(zhì)量濃度（40 μg/mL）進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中、高質(zhì)量濃度紫草素作用于HCT116細胞48 h后均能有效抑制其增殖活性，且具有一定的濃度依賴性趨勢。在此基礎(chǔ)上，本課題組進一步研究紫草素是否誘導HCT116細胞發(fā)生了經(jīng)典的細胞Ⅰ型程序性死亡（凋亡）和Ⅱ型程序性死亡（自噬）。經(jīng) ?Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染流式細胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，HCT116細胞在紫草素的誘導下發(fā)生了凋亡，其中在高質(zhì)量濃度（40 μg/mL）紫草素的誘導下效果最為顯著。

LC3是哺乳動物中酵母ATG8的同源物，參與自噬體的形成，常被作為細胞自噬的標志性因子[20]。本研究結(jié)果顯示，紫草素作用48 h后，細胞中LC3 mRNA的表達水平顯著升高，提示自噬體形成增多。自噬的發(fā)生主要受兩條途徑的調(diào)節(jié)：mTOR途徑和Beclin-1途徑。其中，Beclin-1是哺乳類動物中第1個被確認參與自噬調(diào)節(jié)的特異性基因，主要通過和磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）形成復合體來參與自噬體的形成，在細胞的自噬和凋亡中發(fā)揮著重要作用[21]。本研究結(jié)果顯示，紫草素作用48 h后，HCT116細胞中Beclin-1 mRNA的表達水平顯著升高，提示HCT116細胞中的自噬途徑受到調(diào)節(jié)，促進了自噬體的形成。p62是經(jīng)典的自噬標志基因，是自噬活化過程中的重要調(diào)節(jié)分子，在調(diào)控細胞的生長過程中發(fā)揮著重要作用，最終在自噬溶酶體中進行降解[22]。本研究結(jié)果顯示，紫草素作用48 h后，HCT116細胞中p62 mRNA的表達水平顯著降低，這可能是由于LC3的生成增多，導致了p62的降解加快所致。

LC3蛋白存在LC3Ⅰ與LC3Ⅱ兩種形式：當自噬發(fā)生時，LC3蛋白C端被蛋白酶切割形成LC3Ⅰ，定位于細胞質(zhì);LC3Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾形成 LC3Ⅱ，定位于自噬溶酶體膜上[23-24]。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值能更直觀地反映自噬活性，與自噬體形成的數(shù)量成正比[23-24]。為進一步明確紫草素是否激活HCT116細胞的自噬途徑，本研究采用Western blotting法在分子水平上證實了紫草素作用48 h后可顯著升高HCT116細胞中Beclin-1蛋白表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，顯著降低p62蛋白表達水平。該結(jié)果提示，紫草素可以有效激活HCT116細胞中的Beclin-1自噬途徑，這與伊曲康唑可通過激活人結(jié)腸癌細胞自噬而誘導凋亡的研究結(jié)果一致[25]。

綜上所述，紫草素可誘導人結(jié)腸癌細胞HCT116發(fā)生凋亡，并激活其自噬途徑，提示紫草素可能是有效治療結(jié)腸癌的天然活性藥物之一。但凋亡與自噬之間關(guān)系復雜，有研究顯示，自噬的啟動可誘導細胞凋亡[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，紫草素在誘導HCT116細胞凋亡的同時也能誘導其發(fā)生自噬，但兩者之間具體的相關(guān)機制還需進一步研究。

[14] ZHOU C，JIANG X，LIANG A，et al. COX10-AS1 facilitates cell proliferation and inhibits cell apoptosis in glioblastoma cells at post-transcription level[J]. Neurochem Res，2020. DOI：10.1007/s11064-020-03081-4.

[15] GU ZG，SHEN GH，LANG JH，et al. Effects of long non- coding RNA URHC on proliferation，apoptosis and invasion of colorectal cancer cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2020. DOI：10.26355/eurrev-202008-22444.

[16] LIU G，PEI F，YANG F，et al. Role of autophagy and apoptosis in non-small-cell lung cancer[J]. Int J Mol Sci，2017. DOI：10.3390/ijms18020367.

[17] LI YJ，LEI YH，YAO N，et al. Autophagy and multidrug resistance in cancer[J]. Chin J Cancer，2017，36（1）：52- 85.

[18] GEORGOPOULOS SD，POLYMEROS D，TRIANTAFYLLOU K，et al. Hypergastrinemia is associated with increased risk of distal colon adenomas[J]. Digestion，2006，74（1）：42-46.

[19] ZHAO Q，LI J，WU B，et al. A nano-traditional Chinese medicine against lymphoma that regulates the level of reactive oxygen species[J]. Front Chem，2020. DOI：10.3389/ fchem.2020.00565.

[20] KIHARA A，KABEYA Y，OHSUMI Y，et al. Beclin-phosphatidylinositol 3-kinase complex functions at the trans- Golgi network[J]. EMBO Rep，2001，2（4）：330-335.

[21] YUE Z，JIN S，YANG C，et al. Beclin 1，an autophagy gene essential for early embryonic development，is a haploinsufficient tumor suppressor[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（25）：15077-15082.

[22] APEL A，HERR I，SCHWARZ H，et al. Blocked autophagy sensitizes resistant carcinoma cells to radiation therapy[J]. Cancer Res，2008，68（5）：1485-1494.

[23] GOLDBERG AL. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins[J]. Nature，2003，426（6968）：895-899.

[24] YOSHIOKA A，MIYATA H，DOKI Y，et al. LC3，an autophagosome marker，is highly expressed in gastrointestinal cancers[J]. Int J Oncol，2008，33（3）：461-468.

[25] DENG H，HUANG L，LIAO Z，et al. Itraconazole inhibits the Hedgehog signaling pathway thereby inducing auto- phagy-mediated apoptosis of ?colon cancer cells[J]. Cell Death Dis，2020. DOI：10.1038/s41419-020-02742-0.

[26] WANG L，HU T，SHEN J，et al. Dihydrotanshinone Ⅰ induced apoptosis and autophagy through caspase dependent pathway in colon cancer [J]. Phytomedicine，2015，22（12）：1079-1087.

（收稿日期：2020-08-14 修回日期：2020-09-23）

（編輯：林 靜）