黃夢(mèng)婷 潘玲 鄧?yán)罴t 謝明晏 馬永富 魏梅 程學(xué)仁 徐杰

摘 要 目的：為桑白皮生品和其炮制品（蜜桑白皮）的鑒別及蜜桑白皮炮制終點(diǎn)的確定提供參考。方法：采用超高效液相色譜（UPLC）法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Waters BEH Shield RP C18;流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）;流速為0.30 mL/min;柱溫為30 ℃;程序波長(zhǎng)為280 nm（0～4 min）、320 nm（4～35 min）。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）分別建立13批桑白皮和蜜桑白皮的UPLC指紋圖譜以及進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并結(jié)合對(duì)照品圖譜對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。測(cè)定13批桑白皮和蜜桑白皮粉末的色度值（L、a、b）并計(jì)算其平均總色度值（E），結(jié)合偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）法和聚類分析法分析桑白皮炮制前后指紋圖譜和色度值的差異性;同時(shí)分析不同炮制時(shí)間下蜜桑白皮指紋圖譜和色度值的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以確定其炮制終點(diǎn)。結(jié)果：桑白皮炮制前后指紋圖譜存在明顯差異，13批桑白皮和蜜桑白皮樣品的相似度均在0.9以上。桑白皮、蜜桑白皮圖譜中分別共標(biāo)定了21、23個(gè)共有峰，其中峰1、峰2是桑白皮經(jīng)蜜炙后新產(chǎn)生的化合物;同時(shí)，指認(rèn)了峰2、峰7、峰14、峰19分別為5-羥甲基糠醛、桑皮苷A、氧化白藜蘆醇、桑黃酮G。OPLS-DA分析結(jié)果顯示，峰1、峰2、峰18、峰20的峰面積/稱樣量比值以及色度值（L、a、b）是影響蜜桑白皮炮制前后差異最主要的因素;以E范圍75.84～80.88作為蜜桑白皮的炮制終點(diǎn)，確定炮制時(shí)間為22～34 min。結(jié)論：所建立的UPLC指紋圖譜和色度值的測(cè)定方法可用于桑白皮生品和炮制品的鑒別以及蜜桑白皮炮制終點(diǎn)的確定。

關(guān)鍵詞 桑白皮;蜜桑白皮;色度值;超高效液相色譜;指紋圖譜;最小偏二乘法判別分析;聚類分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for the identification and processing end-point determination of raw Morus alba and its processed products （honey-processed M. alba）. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters BEH Shield RP C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.30 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃. The program wavelengths were set at 280 nm （0-4 min） and 320 nm （4-35 min）. Similarity Evaluation System for Chromatogram Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to establish UPLC fingerprint and carry out similarity evaluation of 13 batches of M. alba and honey-processed M. alba. The chromatographic peaks were identified with reference substance fingerprint. The colorimetric value （L， a， b） of 13 batches of M. alba and honey-processed M. alba powder were determined， and average total colorimetric value （E） was calculated. OPLS-DA and cluster analysis were adopted to analyze the differences in fingerprints and colorimetric values of M. alba before and after processing. At the same time， the dynamic change rule of fingerprint and colorimetric value of honey-processed M. alba at different processing time points were analyzed to determine the processing end-point. RESULTS： There were obvious differences in fingerprints before and after processing， and the similarity of 13 batches of M. alba and honey-processed M. alba were all higher than 0.9. Totally 21 common peaks were calibrated for M. alba， and 23 common peaks for honey-processed M. alba; peak 1 and peak 2 were newly produced compounds of honey-processed M. alba. Peak 2， peak 7， peak 14 and peak 19 were identified as 5-hydroxymethylfurfural， mulberry glucoside A， oxidized resveratrol， mulberry flavonoids G. Results of OPLS-DA showed that the peak area-sample quantity ratio of peak 1， peak 2， peak 18， peak 20 and the chromaticity values （L， a， b） were the most important factors affecting the difference of raw and processed products of M. alba. When the E ranged 75.84-80.88 as the processing end-point of honey-processed M. alba， the processing time was determined as 22-34 min. CONCLUSIONS： The established UPLC fingerprint and colorimetric value determination method can be used to identify the raw and processed products of M. alba as well as determine the processing end-point of honey-processed M. alba.

KEYWORDS Morus alba; Honey-processed Morus alba; Chromaticity; UPLC; Fingerprint; OPLS-DA; Cluster analysis

桑白皮為桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，性寒、味甘，歸肺經(jīng)，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效[1]。桑白皮的主要化學(xué)成分包含黃酮類、酚酸類、生物堿類等，具有降血糖、降血壓、利尿等多種藥理作用[2]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）（后文簡(jiǎn)稱“藥典”）收載的桑白皮飲片包括生品（桑白皮）和蜜炙品（蜜桑白皮）[1]。桑白皮生品性寒，瀉肺行水之力較強(qiáng);用蜜炙法炮制后可減輕其寒瀉之性，防止傷肺瀉氣，同時(shí)兼有潤(rùn)肺止咳的功效，適用于肺虛咳喘[3]。然而，藥典僅在蜜桑白皮飲片鑒別項(xiàng)下作了簡(jiǎn)單的外觀性狀描述，并未明確規(guī)定蜜桑白皮的炒制時(shí)間，亦未規(guī)定指標(biāo)成分的含量檢測(cè)項(xiàng)，導(dǎo)致市面上蜜桑白皮飲片質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響了其臨床用藥的安全性和有效性。

外觀性狀是評(píng)價(jià)中藥材炮制品質(zhì)量的重要依據(jù)之一，不同分析人員對(duì)外觀顏色的分辨存在較大的主觀性[4]。色度分析是利用國(guó)際照明委員會(huì)（CIE）色度空間系統(tǒng)對(duì)顏色進(jìn)行客觀表達(dá)，利用反映色度值的指標(biāo)（L、a、b值）指示顏色在幾何坐標(biāo)軸中的位置，可用于中藥炮制過(guò)程中飲片顏色的快速在線檢測(cè)[5]。中藥指紋圖譜是對(duì)中藥整體性化學(xué)特征的表達(dá)和反映[6]。目前，中藥指紋圖譜結(jié)合色度值測(cè)定在梔子、黨參生品與其炮制品的鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)以及炮制過(guò)程控制等方面應(yīng)用廣泛[7-8]。鑒于此，本研究建立蜜桑白皮炮制前后的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，同時(shí)采用測(cè)定色度值的方法對(duì)蜜桑白皮飲片粉末的顏色進(jìn)行量化，通過(guò)考察不同炒制時(shí)間蜜桑白皮飲片指紋圖譜和色度值的動(dòng)態(tài)變化，為桑白皮生品和炮制品的鑒別以及蜜桑白皮炮制終點(diǎn)的確定提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器

H-class型UPLC儀（美國(guó)Waters公司）;Milli-QDirect型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck股份有限公司）;KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;ME204E型萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;C21-WK2102型多功能電磁爐（美的集團(tuán)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑皮苷A、氧化白藜蘆醇對(duì)照品（成都普菲德生物科技有限公司，批號(hào)：18052901、15112017，純度均為98.0%）;5-羥甲基糠醛對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111626-201902，純度：99.2%）;桑黃酮G對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq20060105，純度：97.0%）;甲醇、乙腈（德國(guó)Merck股份有限公司，色譜級(jí)）;磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜級(jí)）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

本研究共收集13批桑白皮藥材，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定均為?？浦参锷. alba L.的干燥根皮，具體來(lái)源信息詳見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 蜜桑白皮樣品的制備

分別取編號(hào)為S1～S13的桑白皮藥材，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0213蜜炙法[9]制備蜜桑白皮飲片，對(duì)應(yīng)的飲片編號(hào)依次為M1～M13。

2.2 桑白皮和蜜桑白皮UPLC指紋圖譜的建立及分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH Shield RP C18（100 mm×2.1 mm，1.8 ?m）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，2%A;2～12 min，2%A→20%A;12～14 min，20%A→30%A;14～18 min，30%A→48%A;18～22 min，48%A→53%A;22～27 min，53%A→60%A;27～30 min，60%A→87%A;30～30.01 min，87%A→2%A;30.01～35 min，2%A）;流速：0.30 mL/min;柱溫：30 ℃;程序檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm（0～4 min）、320 nm（4～35 min）;進(jìn)樣量：1 μL。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液的制備 分別精密稱取5-羥甲基糠醛、桑皮苷A、氧化白藜蘆醇、桑黃酮G對(duì)照品各適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為75.392 0、63.994 0、129.203 2、78.919 2 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。另取甲醇溶液，作為陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取桑白皮、蜜桑白皮粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同）各0.5 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min;取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，收集續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取蜜桑白皮（編號(hào)：M14）粉末適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。以桑皮苷A的色譜峰作為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 取蜜桑白皮（編號(hào)：M14）粉末適量，共6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液后，然后按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以桑皮苷A的色譜峰作為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取蜜桑白皮（編號(hào)：M14）粉末適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)，然后按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以桑皮苷A的色譜峰作為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 桑白皮與蜜桑白皮UPLC指紋圖譜的建立及共有峰的確定 取13批桑白皮和蜜桑白皮粉末適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖和各特征峰的“峰面積/稱樣量比值”。分別將13批桑白皮和蜜桑白皮的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）中，分別以編號(hào)為S1的桑白皮和編號(hào)為M1的蜜桑白皮的圖譜作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行共有峰匹配，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正分別生成桑白皮對(duì)照?qǐng)D譜R和蜜桑白皮對(duì)照?qǐng)D譜MR，并進(jìn)行各樣本色譜圖與各自對(duì)照?qǐng)D譜的相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，13批桑白皮和蜜桑白皮的UPLC指紋圖譜中分別共標(biāo)定了21、23個(gè)共有峰。13批桑白皮與其對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度依次為0.993、0.989、0.933、0.996、0.999、0.984、0.998、0.993、0.998、0.994、0.998、0.997、0.997，13批蜜桑白皮與其對(duì)照?qǐng)D譜MR的相似度依次為0.992、0.998、0.906、0.995、0.998、0.985、0.996、0.998、0.994、0.993、0.999、0.991、0.998，相似度均在0.9以上，符合指紋圖譜的研究要求。13批桑白皮和蜜桑白皮的共有峰的峰面積/稱樣量比值見(jiàn)表2，UPLC指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖1。

2.2.8 色譜峰的指認(rèn) 分別吸取“2.2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，并分別與桑白皮對(duì)照?qǐng)D譜R和蜜桑白皮對(duì)照?qǐng)D譜MR進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果，共指認(rèn)了其中4個(gè)色譜峰，分別為峰2（5-羥甲基糠醛）、峰7（桑皮苷A）、峰14（氧化白藜蘆醇）、峰19（桑黃酮G）。

2.3 桑白皮和蜜桑白皮色度值測(cè)定

分別取13批桑白皮和蜜桑白皮粉末，每份約2 g，壓制成厚度約為1 mm左右的薄片，以國(guó)際照明委員會(huì)認(rèn)可的D65光源作為光源[6]，以白色作為背景，對(duì)粉末圖像進(jìn)行色彩采集，并進(jìn)行肉眼觀察，采集樣本見(jiàn)圖3。然后，將采集好的圖像導(dǎo)入Adobe Photoshop 6.0軟件中，顏色模型選擇“Lab型”，直接讀取13批桑白皮和蜜桑白皮的色度值（L、a、b值），并計(jì)算平均總色度值（E）。色彩系統(tǒng)中L代表明亮度，L越大則明亮度越大，反之則明亮度越小;a代表紅綠色度，+a為紅色方向，反之為綠色方向，+a值越大則顏色越紅，反之則顏色越綠;b代表黃藍(lán)色度，+b為黃色方向，反之為藍(lán)色方向，+b值越大則顏色越黃，反之則顏色越藍(lán);E為顏色的平均總色度值，E=（L2+a2+b2）1/2）[10]。平行3次測(cè)定，取平均值。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)13批桑白皮和蜜桑白皮的色度值（L、a、b、E）進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。13批桑白皮和蜜桑白皮的色度值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，若單純憑借肉眼看，并不能以粉末外觀顏色很好地區(qū)分桑白皮生品和炮制品。但根據(jù)建立的色度值評(píng)價(jià)法，通過(guò)L、a、b值計(jì)算出總平均色度值E后能客觀地將兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)。除部分批次樣品（編號(hào)為S5、S6、S9、S13）外，桑白皮生品的E值均顯著高于對(duì)應(yīng)批次的蜜桑白皮（P<0.05）。因此，本研究建立的色度值評(píng)價(jià)方法是鑒別桑白皮生品與炮制品的有效手段。

2.4 桑白皮和蜜桑白皮差異標(biāo)志物分析

采用偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）法對(duì)桑白皮炮制前后的差異標(biāo)記物進(jìn)行分析。分別將13批桑白皮和蜜桑白皮樣品各色譜峰的峰面積/稱樣量比值及色度值（L、a、b）導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件中，得到的模型見(jiàn)圖4、圖5。由OPLS-DA得分圖可知，13批桑白皮和蜜桑白皮呈現(xiàn)出明顯的分類聚集現(xiàn)象。根據(jù)模型中變量權(quán)重的重要性（VIP）預(yù)測(cè)值來(lái)篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物;在95%置信區(qū)間的前提下，選出VIP>1.0的因素作為差異性標(biāo)志物[11]。其中，峰1的峰面積/稱樣量比值、峰2（5-羥甲基糠醛）的峰面積/稱樣量比值、L值、a值、b值、峰18的峰面積/稱樣量比值、峰20的峰面積/稱樣量比值的VIP值分別為1.805、1.776、1.581、1.498、1.368、1.134、1.081，均大于1。因此，上述因素是導(dǎo)致桑白皮與蜜桑白皮差異最主要的因素。

2.5 13批桑白皮和蜜桑白皮的聚類分析

將OPLS-DA分析得到的VIP值大于1的各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0軟件中進(jìn)行聚類分析，聚類方法選擇Ward法，測(cè)量區(qū)間選擇平方Euclidean距離，得到聚類結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，桑白皮聚為一類，蜜桑白皮聚為另一類，該結(jié)果與OPLS-DA分析所得的結(jié)果一致，表明峰1、峰2（5-羥甲基糠醛）、峰18、峰20的峰面積/稱樣量比值以及色度值（L、a、b）均可以作為區(qū)分桑白皮與蜜桑白皮的關(guān)鍵指標(biāo)。

2.6 蜜桑白皮炮制過(guò)程中UPLC指紋圖譜和色度值的動(dòng)態(tài)變化考察

2.6.1 蜜桑白皮飲片的炮制和取樣 取桑白皮飲片，按100 g飲片 ∶ 25 g煉蜜的比例加入相當(dāng)于0.75倍煉蜜質(zhì)量的水稀釋的煉蜜，拌勻后悶潤(rùn)至飲片完全潤(rùn)透。當(dāng)入鍋溫度為100 ℃左右時(shí)，投入編號(hào)為S1的桑白皮飲片，開(kāi)始計(jì)時(shí)，在炒制10 min時(shí)開(kāi)始取樣，之后每隔3 min取樣1次，共計(jì)得到15個(gè)時(shí)間點(diǎn)的炮制樣品（共炮制52 min），分別記為MSBP1～MSBP15，同時(shí)記錄出鍋溫度。平行操作3次。蜜桑白皮炮制過(guò)程工藝參數(shù)見(jiàn)表4。

2.6.2 不同炮制時(shí)間蜜桑白皮樣品的UPLC指紋圖譜采集 取不同炮制時(shí)間的15批蜜桑白皮粉末，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖并計(jì)算各特征峰的峰面積/稱樣量比值，結(jié)果見(jiàn)表5。將所有圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）中，以樣品編號(hào)為MSBP1的蜜桑白皮飲片粉末的圖譜為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行共有峰匹配，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正生成蜜桑白皮對(duì)照?qǐng)D譜R，并進(jìn)行各樣品色譜圖與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度評(píng)價(jià)，不同炮制時(shí)間蜜桑白皮飲片的UPLC指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖7。表5結(jié)果顯示，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，峰1的峰面積/稱樣量比值呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì);與炮制10 min的樣品相比，炮制34 min后峰1的峰面積/稱樣量比值增大了3.54倍;繼續(xù)延長(zhǎng)炮制時(shí)間至52 min，峰1的峰面積/稱樣量比值減小了1.15倍。峰2（5-羥甲基糠醛）的峰面積/稱樣量比值在炮制10～43 min內(nèi)一直增大。峰3、峰18、峰20的峰面積/稱樣量比值總體呈現(xiàn)隨炮制時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降的趨勢(shì)。峰7的峰面積/稱樣量比值在炒制10～19 min內(nèi)基本不變;炒制19 min之后，該比值開(kāi)始逐漸下降;炒制34～37 min內(nèi)，該比值下降較為明顯。不同炮制時(shí)間的蜜桑白皮（MSBP1～MSBP15）與其對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度依次為0.932、0.942、0.950、0.951、0.989、0.991、0.999、0.999、0.991、0.972、0.960、0.956、0.978、0.991、0.916，均在0.9以上，符合指紋圖譜的研究要求。

2.6.3 不同炮制時(shí)間蜜桑白皮樣品粉末的色度值測(cè)定 取編號(hào)為MSBP1～MSBP15的樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)15批蜜桑白皮飲片粉末樣品的色度值進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)公計(jì)算各樣品的平均總色度值EMSBP，繪制炮制時(shí)間-色度值變化趨勢(shì)圖，詳見(jiàn)圖8、圖9。結(jié)果顯示，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，蜜桑白皮粉末的顏色逐漸加深;編號(hào)為MSBP1～MSBP4的樣品偏黃白色，編號(hào)為MSBP11～MSBP15的樣品偏棕色至深棕色，均不符合藥典對(duì)蜜桑白皮的性狀要求。編號(hào)為MSBP5～MSBP10的樣品（即炮制22～37 min者）處在深黃色至棕黃色之間，符合藥典中蜜桑白皮飲片鑒別項(xiàng)下要求。色度值的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果顯示，EMSBP在炮制10～22 min內(nèi)基本不變，在炮制22～28 min內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在炮制28～37 min內(nèi)保持穩(wěn)定，之后隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。由此可見(jiàn)，EMSBP的變化基本可以直觀反映蜜桑白皮整個(gè)炮制過(guò)程中顏色的變化規(guī)律：炮制10～22 min內(nèi)，飲片粉末顏色變化不大，呈現(xiàn)黃白色，EMSBP在80.88～83.76之間;炮制22～28 min時(shí)，飲片粉末顏色開(kāi)始發(fā)生明顯變化，由黃白色向深黃色轉(zhuǎn)變，EMSBP由80.88下降至75.62;炮制28～37 min時(shí)，飲片粉末顏色由深黃色緩慢轉(zhuǎn)變至棕黃色，EMSBP在75.19～75.62之間，變化不大;當(dāng)炮制時(shí)間超過(guò)37 min后，飲粉末片顏色明顯加深，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣辽钭厣?，EMSBP由75.19下降至63.22。因此，當(dāng)EMSBP處在75.19～80.88之間時(shí)（即炮制22～37 min者），蜜桑白皮的飲片顏色基本可以達(dá)到藥典的要求。

3 討論

3.1 煉蜜稀釋倍數(shù)考察

本研究考察了蜜桑白皮炮制前煉蜜的稀釋方法，分別為不加水和加0.3、0.5、0.75、1.0倍水稀釋，均悶潤(rùn)3.0 h，觀察煉蜜的流動(dòng)性、飲片的悶潤(rùn)情況。結(jié)果，當(dāng)加0.75倍量水稀釋后煉蜜的流動(dòng)性好，可完全潤(rùn)透飲片。

3.2 桑白皮生品與蜜桑白皮的鑒別

炮制時(shí)間是影響蜜桑白皮飲片質(zhì)量的重要因素，而傳統(tǒng)的外觀顏色鑒別存在主觀性，炮制臨界點(diǎn)的控制較為模糊。不同批次、不同產(chǎn)地的桑白皮飲片顏色有深淺之別，不同炮制程度的蜜桑白皮飲片外觀性狀差別憑肉眼難以區(qū)分;而且桑白皮生品與炮制品物質(zhì)成分的種類差異不大，簡(jiǎn)單的薄層色譜難以有效鑒別。本研究采用UPLC法建立了桑白皮炮制前后的指紋圖譜，其中桑白皮標(biāo)定了21個(gè)共有峰，蜜桑白皮標(biāo)定了23個(gè)共有峰，13批生品中均未檢測(cè)到峰1和峰2（5-羥甲基糠醛），可判定其為桑白皮炮制過(guò)程中新產(chǎn)生的成分。因此，峰1、峰2可以作為區(qū)分桑白皮生品和炮制品的特征性指標(biāo)。同時(shí)，5-羥甲基糠醛（峰2）具有神經(jīng)毒性，如過(guò)量則可能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生積蓄中毒，對(duì)人體橫紋肌及內(nèi)臟造成損害[11]，故應(yīng)作為蜜桑白皮飲片及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，對(duì)其進(jìn)行限量控制可保證臨床用藥的安全性。此外，峰18、峰20的峰面積/稱樣量比值以及飲片粉末色度值（L、a、b）是通過(guò)OPLS-DA分析篩選出的導(dǎo)致蜜桑白皮生品與炮制品差異的關(guān)鍵因素，可作為蜜桑白皮飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)、炮制工藝考察等的重要指標(biāo)。

3.3 蜜桑白皮炮制終點(diǎn)的確定

通過(guò)對(duì)桑白皮炮制前后樣品指紋圖譜的OPLS-DA分析結(jié)果可知，峰1、峰2、峰18、峰20的峰面積/稱樣量比值是反映桑白皮生品和炮制品差異的重要指標(biāo)。因此，筆者重點(diǎn)關(guān)注桑白皮炮制過(guò)程中峰1、峰2、峰18、峰20的峰面積/稱樣量比值的變化規(guī)律后發(fā)現(xiàn)：隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，峰1的峰面積/稱樣量比值呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在炮制34 min時(shí)該比值達(dá)到較高水平，說(shuō)明炮制34 min是峰1代表的化學(xué)成分含量變化的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，若炮制時(shí)間控制在34 min左右，可有效保留峰1化合物的含量;峰2（5-羥甲基糠醛）的峰面積/稱樣量比值在炮制10～43 min內(nèi)一直增大，這可能與煉蜜或藥物在加熱炒制的過(guò)程中單糖發(fā)生脫水有關(guān)[12]。相關(guān)研究表明，5-羥甲基糠醛具有雙向藥理作用，既有抗氧化損傷[11]、抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散[13]、抗組織缺氧[14]等有利的藥理作用，又有致敏性[15]、遺傳毒性[16]等副作用，故在蜜桑白皮飲片性狀達(dá)到要求的前提下，炒制時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，避免5-羥甲基糠醛的累積而產(chǎn)生毒副作用。隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，峰18、峰20的峰面積/稱樣量比值總體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。此外，峰3的峰面積/稱樣量比值也隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。峰7（桑皮苷A）是蜜桑白皮最主要的化學(xué)成分，其峰面積占總峰面積的65%以上。相關(guān)研究表明，桑皮苷A具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳、抗腫瘤、抗病毒、保護(hù)大腦等多種生物活性，是桑白皮的主要藥效成分之一[17]。本研究結(jié)果顯示，桑皮苷A的峰面積/稱樣量比值在炮制10～19 min內(nèi)基本不變;炮制19 min之后，該比值開(kāi)始逐漸下降;炮制34～37 min內(nèi)，該比值下降較為明顯?？芍?，當(dāng)炒制時(shí)間超過(guò)34 min時(shí)不利于桑皮苷A的保留。

結(jié)合蜜桑白皮炮制過(guò)程中飲片指紋圖譜各共有峰的峰面積/稱樣量比值和色度值的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為保證蜜桑白皮既符合藥典的外觀性狀要求，同時(shí)避免炮制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致峰1、峰3、桑皮苷A（峰7）、峰18、峰20等成分含量的下降，以及防止5-羥甲基糠醛（峰2）的過(guò)度累積，筆者認(rèn)為蜜桑白皮炮制結(jié)束時(shí)的EMSBP范圍應(yīng)在75.84～80.88之間，即炒制時(shí)間控制在22～34 min為宜。但由于不同批次桑白皮生品顏色存在差異，本研究以“EMSBP在75.84～80.88”作為蜜桑白皮的炮制終點(diǎn)是否具有廣泛的代表性，有待擴(kuò)大樣本進(jìn)行深入研究。

綜上，本研究建立了桑白皮炮制前后的UPLC指紋圖譜，同時(shí)采用色度值對(duì)蜜桑白皮粉末的顏色進(jìn)行量化，篩選出了鑒別桑白皮生品和炮制品的關(guān)鍵指標(biāo);同時(shí)根據(jù)不同炒制時(shí)間下蜜桑白皮飲片指紋圖譜和色度值的動(dòng)態(tài)變化，初步確定了蜜桑白皮的炮制終點(diǎn)。本研究結(jié)果可為桑白皮生品和炮制品的鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)以及蜜桑白皮炮制工藝的優(yōu)化提供有益參考。

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（收稿日期：2020-10-12 修回日期：2020-11-27）

（編輯：林 靜）