劉澤文，袁芳艷，劉 威，高 婷，周丹娜，楊克禮，段正贏，郭 銳，梁 婉，田永祥

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是一種可引起人獸共患傳染病的重要?jiǎng)游锊≡?，該菌按莢膜抗原共分為35個(gè)血清型，其中豬2型鏈球菌(Streptococcussuistype 2，SS2)是其中致病力最強(qiáng)的一種，該菌不但能引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎甚至死亡[1-2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也可導(dǎo)致養(yǎng)豬從業(yè)人員感染和死亡，因此對其進(jìn)行預(yù)防和控制研究十分必要。本研究從湖北多個(gè)地市的發(fā)病豬場采集病料，分離鑒定豬2型鏈球菌16株，并進(jìn)行全部分離菌株的藥敏試驗(yàn)，旨在為臨床控制鏈球菌病提供用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，按說明書配制、滅菌后加入50 mL/L的小牛血清。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 豬SS2標(biāo)準(zhǔn)菌株，由國藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司提供。

1.1.3 藥敏紙片 頭孢呋辛、頭孢曲松等藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；氟苯尼考藥敏紙片，Oxoid公司產(chǎn)品，按藥敏紙片生產(chǎn)公司提供的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.1.4 主要試劑和儀器設(shè)備 2×TaqMaster mix(Dye plus)，Vazyme公司產(chǎn)品；新生牛血清，浙江杭州生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Applied Biosystems PCR儀，Life technologies公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；凈化工作臺,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集和培養(yǎng) 采集湖北武漢、黃石、黃岡、十堰、荊州等地市發(fā)病豬的腦、關(guān)節(jié)液、心血和肺等，接種于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑選帶藍(lán)光的單個(gè)菌落，再接種TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 染色和鏡檢 挑選純化培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，挑選呈短鏈、長鏈狀球菌為疑似豬鏈球菌進(jìn)行下一步鑒定。

1.2.3 PCR鑒定

1.2.3.1 PCR引物和PCR擴(kuò)增 按文獻(xiàn)[3]合成引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描照相。豬鏈球菌鑒定引物(SS-1和SS-2)擴(kuò)增長度566 bp，豬2型鏈球菌鑒定引物(SS2-1和SS2-2)擴(kuò)增長度498 bp。

1.2.3.2 豬鏈球菌的PCR鑒定 挑選疑似豬鏈球菌的48株純培養(yǎng)物于無菌水中，100 ℃煮沸10 min～15 min作為PCR 模板。用SS-1和SS-2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描照相。

1.2.3.3 豬2型鏈球菌菌株的PCR鑒定 以SS2-1、SS2-2引物對鑒定為豬鏈球菌陽性樣品模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描照相。

1.2.4 分離菌株的生化鑒定 將PCR鑒定呈陽性的豬2型鏈球菌接種改良TSB培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)18 h～20 h，分別接種糖發(fā)酵和其他生化試驗(yàn)培養(yǎng)基小管，每管0.2 mL，37 ℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.2.5 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 將分離純化的菌株按常規(guī)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[4]。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)和染色特性

分離的疑似豬鏈球菌菌落直徑針尖大小、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊(圖1)；革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，可見革蘭氏染色陽性、單個(gè)、成對或成鏈狀排列的球菌(圖2)。

圖2 分離菌株革蘭氏染色結(jié)果

圖1 分離菌株菌落形態(tài)

2.2 豬鏈球菌PCR鑒定結(jié)果

對革蘭氏染色疑似豬鏈球菌的48株分離菌株用豬鏈球菌鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有34株分離菌株擴(kuò)增到目的條帶(圖3)，鑒定為豬鏈球菌，其病料來源和分離部位見表1。

表1 病料來源及部位

2.3 豬2型鏈球菌PCR鑒定結(jié)果

對經(jīng)PCR鑒定為豬鏈球菌的34株分離菌株用SS2型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有16株分離菌株擴(kuò)增到目的條帶(圖4)，鑒定為豬2型鏈球菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; P.陽性對照; 1～34.分離菌株M.DNA Marker DL 2 000; P.Postive control; 1-34.Isolated strains

2.4 生化鑒定結(jié)果

挑選鑒定為豬2型鏈球菌菌株進(jìn)行生化鑒定，其生化鑒定結(jié)果符合豬鏈球菌生化特性(表2)。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的豬鏈球菌對頭孢呋辛、頭孢曲松、阿莫西林和氨芐西林全部高度敏感，對林可霉素、依諾沙星、洛美沙星、卡那霉素、四環(huán)素、阿米卡星、慶大霉素和磺胺異惡唑等全部耐藥(表3)。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)豬鏈球菌病主要病原[5]，該病呈世界范圍流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[6]。我國于1990年首次報(bào)道廣東省有該病的發(fā)生[7]。近年來，豬鏈球菌病的發(fā)病呈上升趨勢[8-10]，該病往往發(fā)病急，死亡快，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失，其中豬鏈球菌臨床檢出率最高、毒力最強(qiáng)的血清型是豬2型鏈球菌[11-12]。豬2型鏈球菌又是重要的人畜共患病原菌，可引起腦膜炎、感染性休克，嚴(yán)重時(shí)可致人死亡。該病自丹麥1968年首次報(bào)道以來[13]，我國和世界其他地方多次出現(xiàn)豬2型鏈球菌感染人的報(bào)道[14-15]。因此，豬鏈球菌病不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，也給公共衛(wèi)生和食品安全帶來了嚴(yán)重危害，需要對此病的流行引起高度重視。我國已將豬鏈球菌病列為二類動(dòng)物疫病。

從湖北武漢、宜昌、十堰等10個(gè)地區(qū)的29個(gè)縣(市、區(qū))的48份樣品中分離出豬2型鏈球菌16株，占全部分離鏈球菌的47.1%，說明湖北省豬鏈球菌中主要以2型鏈球菌為主導(dǎo)。16株2型鏈球菌分布于湖北省10地區(qū)的15個(gè)縣(市、區(qū))，調(diào)查結(jié)果表明，豬2型鏈球菌在湖北省各地分布廣泛，隨著環(huán)境條件改變及豬群免疫力降低，容易造成豬鏈球菌病的發(fā)生，因此對豬鏈球菌的防治應(yīng)該引起足夠的重視。

通過對16株2型鏈球菌分離菌株的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示全部菌株對頭孢呋辛、頭孢曲松、阿莫西林和氨芐西林的高度敏感；對卡那霉素、四環(huán)素、阿米卡星、慶大霉素和磺胺異惡唑全部耐藥，16株分離菌株耐藥在7種和11種之間。結(jié)果說明，分離的豬2型鏈球菌存在嚴(yán)重的多重耐藥性，因此臨床上對于豬鏈球菌病的治療,在早期可采用2種～3種藥物進(jìn)行試驗(yàn)性治療，在病情得到確診以后，應(yīng)當(dāng)先進(jìn)行細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)，篩選敏感藥物進(jìn)行治療，以免延誤治療時(shí)機(jī)。同時(shí)在使用藥物進(jìn)行豬鏈球菌病預(yù)防時(shí)，可采用幾種藥物交替使用，避免長期使用同一種藥物，以防細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。