宋予震，史洪濤，范明夏，夏艷勛，邊傳周，喬宏興

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院，河南鄭州 450046)

微生物在自然界廣泛存在，益生菌作為有益微生物在動物生產(chǎn)中發(fā)揮著獨特作用，如提高動物生產(chǎn)性能、產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物、提高機體抗病能力、降低死亡率、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等。中藥是我國的國粹，中醫(yī)藥文化博大精深，在畜牧生產(chǎn)上具有治未病、降低耐藥性、減少藥物殘留、綠色環(huán)保等優(yōu)點。微生物發(fā)酵中藥歷史悠久，因其具有獨特的優(yōu)勢被廣泛應用。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展，微生物發(fā)酵中藥將會成為新興的抗生素替代品。

1 微生物發(fā)酵中藥概念及起源

關于微生物發(fā)酵中藥的歷史源遠流長，就是借助微生物作用，在適當?shù)慕臃N量、溫度、時間、濕度等條件下對中藥進行發(fā)酵，一方面中藥在發(fā)酵過程中會發(fā)生一系列的生化反應，從而引起中藥的活性成分發(fā)生改變；另一方面中藥的某些成分通過誘導微生物代謝途徑改變產(chǎn)生新的活性物質(zhì)[1-2]。漢晉時期，漢醫(yī)經(jīng)典著作《金匱要略》中就出現(xiàn)了關于發(fā)酵中藥“神曲”的詳細記載；北魏期間，賈思勰的《齊民要術》、《肘后方》 等古代醫(yī)學典籍中就有對天然發(fā)酵炮制方法及應用的描述[3-4]；在倪朱謨的《本草匯言》中也記錄了多種天然發(fā)酵而成的有效中藥，如采云曲、沉香曲、半夏曲、紅曲、建神曲等[5]。中國古代醫(yī)學書籍對發(fā)酵炮制藥物記錄眾多，而被《中國藥典》收錄的僅有半夏曲、百藥煎、淡豆豉和炒六神曲4種。隨著微生物學、發(fā)酵中藥學、基因工程學等交叉學科發(fā)展，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵中藥方式引入了新的技術手段，研究范圍不斷擴大。同時，發(fā)酵所需要的條件、成分檢測、產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定可控[5]。鑒于微生物發(fā)酵中藥機理尚未闡明，而且生物界還有許多有待系統(tǒng)研究的微生物，該領域具有很大的研究空間。因此，將傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代生物發(fā)酵技術有機結(jié)合而發(fā)展起來的新型制藥技術已成為行業(yè)研究的熱點。

2 中藥發(fā)酵后作用的變化

2.1 提高中藥有效成分的利用率

中藥發(fā)揮藥理藥效作用的有效成分主要存在于細胞間質(zhì)包裹的胞漿和植物細胞壁中，而細胞壁是由不同纖維和膠質(zhì)類物質(zhì)組成的細胞外結(jié)構(gòu)。因此，在中藥提取過程中需要克服多重阻力，才能將胞漿中的有效活性成分釋放出來[6-7]。微生物酶系種類繁多且酶活力強，主要包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等，這些酶能將植物細胞壁中的纖維素、半纖維素及果膠等致密結(jié)構(gòu)成分分解利用或轉(zhuǎn)化為其他成分，使植物細胞壁的結(jié)構(gòu)變疏松，細胞間隙增大，有效成分釋放阻力減小，易于從細胞內(nèi)析出，從而極大地簡化提取步驟，提高中藥提取率[8]。賈艷姝[9]將黃芪經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與黃芪粉煎煮液相比，黃芪發(fā)酵后總黃酮增加了近14%，總皂苷增加了20%以上。結(jié)果表明，黃芪經(jīng)發(fā)酵后能顯著提高有效活性成分的析出率。

2.2 產(chǎn)生新的活性成分

微生物結(jié)構(gòu)簡單，但產(chǎn)酶豐富，具備超強的合成轉(zhuǎn)化功能且能生成大量的次級代謝產(chǎn)物。在其生長繁殖和新陳代謝過程中能催化中藥生成多種新物質(zhì)，進而產(chǎn)生新的藥理活性。中藥人參在發(fā)酵過程中可將人參皂苷中的大分子糖苷進行目的性水解，從而生成具有高效生物活性的小分子苷元和皂苷。例如，紅參浸膏經(jīng)細腳擬青霉(Paecilomycestenuipes) 發(fā)酵后其中的人參二醇型皂苷能轉(zhuǎn)變?yōu)槿藚⒃碥誇2、Rk1、Rh2、Rg3、Rg5和C-K[10]。張玲等[11]用微生物發(fā)酵鬼針草莖、葉后總黃酮中HPLC指紋圖譜有較明顯的改變，各吸收峰相對率有較顯著的改變。說明鬼針草莖、葉經(jīng)微生物發(fā)酵后其總黃酮中某些化學成分發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，其化學成分的組成有較顯著的變化。

2.3 降低毒副作用

有些中藥在擁有較強生物活性的同時也具有一定的毒副作用，這在很大程度上限制了中藥的推廣和普及。而采用微生物發(fā)酵的方法可降低中藥的毒性，對其有毒成分進行修飾，或其毒性成分如生物堿類、苷類、毒蛋白類、金屬元素等被微生物分解轉(zhuǎn)化，使毒性降低或消失。朱舟等[12]利用雙向發(fā)酵技術對天南星與白僵菌進行處理得到抗驚厥力較高、毒性較小的產(chǎn)物，達到減毒增效的目的。

2.4 增強中藥藥效

中藥成分結(jié)構(gòu)復雜，很多大分子活性物質(zhì)不能直接被機體吸收利用。在發(fā)酵過程中，通過微生物強大的分解功能將大分子活性物質(zhì)降解為有效的小分子活性物質(zhì)，有利于透過機體的屏障系統(tǒng)與相關細胞蛋白結(jié)合，從而被機體吸收利用，提高中藥的作用效果[13]。陳永強等[14]研究證明，β-葡萄糖醛酸酶能將甘草中的甘草酸轉(zhuǎn)化成甘草次酸，從而被消化系統(tǒng)直接吸收利用，使機體在短時間內(nèi)達到較高的血藥濃度，并迅速作用于靶器官，從而發(fā)揮甘草的消炎、止痛作用。

2.5 節(jié)約藥材資源，保護生態(tài)環(huán)境

經(jīng)提取利用后的中藥藥渣常常被廢棄，不僅浪費資源，并且污染環(huán)境。通過益生菌發(fā)酵中藥技術，以中藥殘渣作為培養(yǎng)基質(zhì)進行發(fā)酵，在滿足微生物營養(yǎng)需求的同時，又能充分釋放中藥的有效成分，產(chǎn)生新的藥理作用，同時減少中藥殘渣對環(huán)境的污染，在提高中藥資源利用率的同時降低生產(chǎn)成本。李秀穎等[15]將黃姜藥渣與其他成分混合制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加膠質(zhì)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等益生菌進行生物發(fā)酵，得到了成本低廉、環(huán)保安全的生物有機肥料。因此，利用發(fā)酵技術不僅使藥渣重新被合理利用，避免資源浪費，而且還保護了生態(tài)環(huán)境。

3 中藥微生物發(fā)酵的方式

中藥微生物發(fā)酵方式有固體發(fā)酵、液體發(fā)酵和雙向固體發(fā)酵技術[16]。固體發(fā)酵是一種相對完善的發(fā)酵工藝，具有悠久的歷史，其設備簡單且操作方便。在自然開放的條件下以單一或多種真菌對農(nóng)產(chǎn)品或某些中藥材進行發(fā)酵。雖然固體發(fā)酵有很多獨特的優(yōu)勢，但因其工藝存在一定局限性，比如培養(yǎng)體系開放，發(fā)酵速度慢且缺乏科學的評判標準，很難實現(xiàn)大規(guī)模批量生產(chǎn)[16]。劉洋等[17]用糞腸球菌等多種復合菌種對益母草和王不留行進行固體發(fā)酵，并測定有效活性成分的含量，探索發(fā)酵后中藥活性成分變化情況。結(jié)果顯示，與未發(fā)酵組相比，發(fā)酵后中藥可溶性總黃酮提高了約55%，總生物堿提高了約127%，粗多糖提高了約55%，總皂苷提高了近50%。

液體發(fā)酵時間短，生產(chǎn)條件易控、生產(chǎn)成本小、易實現(xiàn)機械自動化、具有工藝擴大等優(yōu)點，因而具有廣泛的應用前景。但液體發(fā)酵對發(fā)酵條件及生產(chǎn)工藝要求高，在發(fā)酵過程中污染幾率較大[16]。梅建鳳等[18]將分離到的一株黑曲霉JH-2菌株接種液體培養(yǎng)基并與積雪草粉進行液體發(fā)酵，使積雪草苷轉(zhuǎn)化為積雪草酸，與未轉(zhuǎn)化的對照組相比，質(zhì)量分數(shù)提高3.03倍。

20世紀80年代后期，在固體發(fā)酵基礎之上發(fā)展起來的一種真菌與中藥有機結(jié)合的發(fā)酵工藝，稱為雙向固體發(fā)酵技術。是將含有部分活性物質(zhì)的中藥或殘渣與有益菌種進行發(fā)酵。在此過程中，一方面中藥材能為真菌提供所需營養(yǎng)物質(zhì)，使菌體大量繁殖；另一方面因真菌生長產(chǎn)生的各種酶的影響，使真菌代謝產(chǎn)物或細胞因子與中藥材自身結(jié)構(gòu)進行互作而改變其原有成分，產(chǎn)生不同的性味功效，從而決定了其具有雙向發(fā)酵性[16]。朱舟等[19]將天南星用白僵菌進行固體雙向發(fā)酵，結(jié)果顯示，天南星的形態(tài)和性狀都發(fā)生改變，其毒性大大降低，生品天南星的半數(shù)致死量(LD50)顯著降低。因不同藥用菌的酶體系不同，以及不同藥材品種繁多，成分差異大，實現(xiàn)真菌與藥材的有機結(jié)合發(fā)酵還缺乏完整的科學理論依據(jù)做支撐，仍然需要進一步論證，但雙向性發(fā)酵技術將會成為中藥發(fā)酵領域的一顆冉冉新星。

4 發(fā)酵中藥存在的問題

目前，利用現(xiàn)代生物科學技術對中藥進行生物轉(zhuǎn)化在畜牧、醫(yī)療保健等行業(yè)已成為研究熱點。通過微生物發(fā)酵中藥能促進有效成分的分解轉(zhuǎn)化，在保護中藥成分免受物理工藝造成破壞的同時，增強中藥藥效、提高中藥有效成分析出效果[13]。然而，發(fā)酵中藥作為一種新型制劑，在理論研究和生產(chǎn)工藝方面尚不完善。缺乏規(guī)范性的質(zhì)量標準，如中藥品種繁多、成分復雜多樣、發(fā)酵機理不明確、微生物代謝多樣性等都制約著中藥發(fā)酵技術的發(fā)展，影響發(fā)酵中藥工藝控制和臨床應用效果。

4.1 中藥發(fā)酵作用機理不明確

雖然檢測技術越來越先進，但中藥成分復雜，從中藥成分的角度研究發(fā)酵中藥其機理仍然不清楚。中藥發(fā)酵前后活性物質(zhì)變化較大，但在發(fā)酵過程中究竟轉(zhuǎn)化利用了哪種物質(zhì)，以及產(chǎn)生了哪種新成分還有待進一步研究[20]。發(fā)酵中藥的藥理藥效學研究能更直接說明發(fā)酵工藝對中藥的影響，未來需要進一步的深入研究。

4.2 優(yōu)良發(fā)酵菌種的選擇

菌種是發(fā)酵中藥的重要前提和核心，目前常用于畜牧業(yè)發(fā)酵的菌株主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和部分霉菌。微生物種類繁多，且產(chǎn)生的酶體系各不相同，微生物代謝利用的物質(zhì)也不盡相同。但并非所有的菌種都適合發(fā)酵，因此根據(jù)不同中藥選擇合適的發(fā)酵菌種，使發(fā)酵后中藥藥效增強、有效成分析出率提高、毒副作用降低、產(chǎn)生新的活性成分，使藥物利用率達到最大，還需要充分的試驗研究論證[20]。例如，在傳統(tǒng)發(fā)酵淡豆豉過程中一般選擇自然菌，而內(nèi)生真菌通過發(fā)酵可能會產(chǎn)生某些抗癌成分[21-22]。

4.3 發(fā)酵中藥材的選擇

在微生物發(fā)酵過程中并不是所有的中藥都適合發(fā)酵，有研究用芽孢桿菌(Bacilllussubtilis)對幾十種藥材進行生物發(fā)酵，檢測其抗菌活性的特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，并非所有中藥都適合發(fā)酵。連翹、半夏曲、六神曲等藥物通過發(fā)酵活性加強，而大部分藥材的藥效在發(fā)酵后沒有明顯改變，而少數(shù)中藥經(jīng)發(fā)酵后其藥效卻顯著下降，因此需要通過大量的基礎研究篩選中藥作為發(fā)酵原料[20]。

4.4 中藥發(fā)酵工藝參數(shù)的選擇和控制

在微生物發(fā)酵中藥工藝中影響發(fā)酵過程變化的因素有很多，包括物理參數(shù)，如溫度、空氣流量、濁度等；化學參數(shù)，如pH、產(chǎn)物含量、溶氧量等；生物參數(shù)，如菌體比生長速率、基質(zhì)消耗速率、關鍵酶活力、接種量等三大類。怎樣根據(jù)藥材、菌種等特點確定最適發(fā)酵條件與終點，尋找發(fā)酵過程中科學的觀測指標，在不斷進行工藝優(yōu)化中提高生產(chǎn)效率，也是微生物發(fā)酵工藝難點之一[23]。

4.5 中藥發(fā)酵模型的篩選和建立

目前，利用微生物發(fā)酵中藥是提高中藥藥效的有效途徑，但藥材自身特點合適不同發(fā)酵菌種與不同中藥材如何組合是發(fā)酵的關鍵。通過對不同發(fā)酵菌、發(fā)酵產(chǎn)物以及中藥有效成分進行研究來篩選不同中藥材和不同發(fā)酵菌種組合進行發(fā)酵，在大幅度減少成本的同時還增加中藥藥效，是未來中藥發(fā)酵的新途徑，可實現(xiàn)中藥與微生物最優(yōu)組合的應用[20]。

5 發(fā)酵中藥在動物生產(chǎn)上的應用

發(fā)酵中藥是益生菌、中藥和代謝產(chǎn)物的組合，根據(jù)目前養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展趨勢，發(fā)酵中藥以“治未病”為原則，通過增強動物的生理機能和免疫力，達到提高動物生產(chǎn)性能、不發(fā)病或少發(fā)病的目的。

喬宏興等[24]在肉雞飼料中添加適量的發(fā)酵黃芪進行飼喂。結(jié)果顯示，與黃芪組相比，肉雞平均日增重顯著升高，料肉比下降。且血清中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶總活力(tatol superoxide dismutase,T-SOD)活性升高，進而增強肉雞的抗氧化水平，因此發(fā)酵黃芪能改善肉雞生產(chǎn)性能和抗氧化機能。史同瑞等[25]在蛋雞日糧中添加2 g/kg的解淀粉芽孢桿菌SSY1株發(fā)酵黃芪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能提高蛋雞的綜合產(chǎn)蛋率，提高蛋重，降低料蛋比，改善雞蛋品質(zhì)，增強蛋雞的抗氧化性能，提高蛋雞健康水平。

趙圣振等[26]用植物乳桿菌和屎腸球菌混合固體發(fā)酵黃芪樣品，以不同量添加于35日齡斷奶仔豬基礎日糧進行飼喂，結(jié)果表明，與抗生素組相比，料肉比下降約6%(P<0.05)，日增重提高近20%(P<0.05)，采食量增加約12%(P<0.05)，IgA和IgG分別提高約22%(P<0.05)和30%(P<0.05)。韓宇等[27]給斷奶仔豬飼喂添加發(fā)酵黃芪的基礎日糧，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，發(fā)酵制劑能有效提高豬只日增重、增強機體抗病力；與抗生素對照組相比，發(fā)酵制劑能顯著改善仔豬健康狀況，降低仔豬腹瀉率，提高成活率。

6 展望

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，限抗、禁抗工作正有力推進，尋找一種綠色、安全、高效的抗生素替代品是畜牧業(yè)的重要研究方向。益生菌發(fā)酵中藥是借助于微生物在一定條件下對中藥進行生物轉(zhuǎn)化，提高中藥藥效。同時，微生物在代謝過程中能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，維持腸道菌群平衡，提高動物機體的健康度。此外，益生菌發(fā)酵中藥安全高效、綠色環(huán)保的優(yōu)點奠定了其在畜牧生產(chǎn)中廣泛應用的基礎。益生菌發(fā)酵中藥將會成為抗生素的首選替代品。