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        通腎顆粒的亞慢性毒性試驗(yàn)

        2021-01-26 07:55:44王雅倩侯會(huì)霞邊小利王虹雅陳胡羚張芬芳李引乾
        關(guān)鍵詞:劑量

        王 軍,王雅倩,侯會(huì)霞,邊小利,王虹雅,陳胡羚,張芬芳,4,孫 蓉,李引乾*

        (1.陜西漢中市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,陜西漢中 723000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;3.陜西省府谷縣麻鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站,陜西府谷 7194003;4.陜西省眉縣畜牧獸醫(yī)工作站,陜西眉縣 722300)

        腎炎(nephritis)是臨床上以水腫、腎區(qū)疼痛、尿量改變、尿液含有多量上皮細(xì)胞和管型為特征的腎小球、腎小管或腎臟間質(zhì)組織發(fā)生炎癥的病理過程[1]。發(fā)病多與感染、毒物刺激和變態(tài)反應(yīng)有關(guān)[2]。臨床治療以消炎利尿、抑制免疫反應(yīng)和清熱利濕、止血涼血為主[3-4]。通腎顆粒由黃芪、苦參、白茅根、金銀花等中藥組成,具有可清熱燥濕,清熱利尿和清熱解毒之功效,臨床上用于治療以水腫、尿少、尿血、腰部疼痛等為主癥的腎炎。為考察通腎顆粒的安全性,根據(jù)《獸藥試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范匯編》[5]中有關(guān)獸藥亞慢性毒性試驗(yàn)的要求進(jìn)行本試驗(yàn),以評(píng)價(jià)通腎顆粒的安全性,為進(jìn)一步制定臨床試驗(yàn)給藥方案提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠共100只,雌雄各半,初始體重200 g~240 g,購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物于試驗(yàn)前均觀察7 d,臨床檢查健康者即用于試驗(yàn)。

        1.1.2 藥品與試劑 通腎顆粒(主要成分為黃芪、苦參、白茅根和金銀花等)(批號(hào):20181011),河南惠通天下生物工程有限公司提供;二甲苯(批號(hào):20171210),廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究工發(fā)有限公司產(chǎn)品;無水乙醇(批號(hào):20171028),廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品;甲醛(批號(hào):20171125),天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品;石蠟(批號(hào):20171022),撫順東科蠟業(yè)有限公司產(chǎn)品;蘇木精(批號(hào)20170825)、伊紅(批號(hào):20171115),上?;瘜W(xué)試劑站分裝廠;丙酮(批號(hào):20171125),天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品;真空血樣采集容器(EDTA-K2)(批號(hào):20180101),江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品;真空血樣采集容器(肝素鈉)(批號(hào):20180201),江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司;生理鹽水(批號(hào):D161201121),山東科倫藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;尿素氮測定試劑盒(批號(hào):339101)、肌酐測定試劑盒(批號(hào):262609)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(批號(hào):797231)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(批號(hào):654263)、葡萄糖測定試劑盒(批號(hào):245460)、總蛋白測定試劑盒(批號(hào):230433)、白蛋白測定試劑盒(批號(hào):245621),日本富士膠片株式會(huì)社。

        1.1.3 儀器設(shè)備 FUJIFILM DRI-CHEM4000ie干式生化分析儀,日本富士膠片株式會(huì)社產(chǎn)品;Sysmex XT-1800i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀,日本東亞公司產(chǎn)品;TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī),湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品;FA1204B電子天平,上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;精密旋轉(zhuǎn)切片機(jī),美國AO公司產(chǎn)品;XSZ-4U生物顯微鏡,重慶麥克光電儀器有限公司產(chǎn)品;MOTIC顯微鏡,麥克奧迪公司產(chǎn)品。

        1.2 方法

        1.2.1 試驗(yàn)分組 將100只SD大鼠隨機(jī)分為4組,3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,3個(gè)試驗(yàn)組分別為通腎顆粒高、中、低劑量組,對(duì)照組為生理鹽水組[6]。

        1.2.2 給藥劑量及給藥途徑 現(xiàn)用現(xiàn)配,用溫開水沖入通腎顆粒藥中使其溶解,按試驗(yàn)組梯度及大鼠體重灌胃給藥。試驗(yàn)組高、中、低劑量組的劑量分別為12、6、3 g/kg,根據(jù)大鼠體重以1 mL/100 g適量給藥。對(duì)照組同樣按體重使用等體積的生理鹽水每日灌胃給予。試驗(yàn)期為6周,期間連續(xù)給藥,每周定時(shí)早上7:00時(shí)稱量體重1次,隨大鼠體重變化適時(shí)當(dāng)周調(diào)整給藥劑量,停藥后正常飼喂繼續(xù)觀察2周[7]。

        1.2.3 觀察指標(biāo)

        1.2.3.1 一般健康狀況 試驗(yàn)期間,每日定時(shí),間隔3 h~6 h觀察大鼠的行為、精神狀態(tài)、飲水量、采食量、糞便、發(fā)病及死亡等情況。若有大鼠死亡,及時(shí)記錄并進(jìn)行病理學(xué)檢查[8-9]。

        1.2.3.2 體重 分別于試驗(yàn)的第0、1、2、3、4、5、6周早晨空腹逐只稱量體重,計(jì)算組間差異。

        1.2.3.3 血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)測定 參照文獻(xiàn)[10],于末次給藥后24 h和停藥2周后分別每組各取10只大鼠(雌雄各5只),麻醉后,立即切開小鼠下腹部從下腔靜脈采血于加有EDTA的抗凝管中,應(yīng)用Sysmex XT-1800i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀分析血液中的紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)和血紅蛋白(Hb)。同時(shí)采集血液于離心管中,自然凝固,離心,分離血清,用血液生化分析儀測定以下血清生化指標(biāo):總蛋白(TP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、總膽固醇(TC)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)。

        1.2.3.4 臟器系數(shù) 參照文獻(xiàn)[11],試驗(yàn)結(jié)束后,當(dāng)日處死動(dòng)物,稱量大鼠體重,取心、肝、脾、肺、腎,并稱取重量,計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100。

        1.2.3.5 病理學(xué)檢查 大鼠采血后實(shí)施安樂死后進(jìn)行剖檢,觀察主要臟器有無眼觀可見的病理學(xué)變化,按常規(guī)方法制備記錄結(jié)果。取心、肝、脾、肺、腎,各取保留特征區(qū)域的約拇指大小規(guī)則塊,加以100 mL/mL中性福爾馬林固定,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片,HE染色,光鏡下觀察[12-13]。

        2 結(jié)果

        2.1 體重變化結(jié)果

        在6周試驗(yàn)期間,持續(xù)觀察顯示,試驗(yàn)組高、中、低劑量組與對(duì)照生理鹽水組的大鼠無論雌雄均狀態(tài)良好,精神正常,被毛整齊,活動(dòng)自如,食欲旺盛,代謝正常,未出現(xiàn)中毒和死亡。各組大鼠體重變化見表1、表2。

        由表1和表2可見,試驗(yàn)期間,每日持續(xù)灌服通腎顆粒,每周對(duì)大鼠體重進(jìn)行稱量,試驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠體重表現(xiàn)出了不同的變化。雄性大鼠結(jié)果顯示,通腎顆粒高劑量組在第4周開始直到第6周試驗(yàn)結(jié)束,體重與對(duì)照組存在差異,表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01),而中劑量組從第4周開始,與生理鹽水組相比差異極顯著(P<0.01),而低劑量組在整個(gè)試驗(yàn)期間(6周)與生理鹽水組差異均不顯著(P>0.05)。雌性大鼠結(jié)果顯示,高劑量和中劑量組在試驗(yàn)期間基本與對(duì)照生理鹽水組差異不顯著(P>0.05),低劑量組雌性大鼠從第2周開始與生理鹽水組差異顯著(P<0.05)。高、中劑量組通腎顆粒對(duì)雄性大鼠的生長有一定的抑制作用,高劑量組對(duì)雌性大鼠的生長有一定的抑制作用。

        表1 試驗(yàn)期間各組雄性大鼠體重變化

        表2 試驗(yàn)期間各組雌性大鼠體重變化

        2.2 血液學(xué)和生化指標(biāo)測定結(jié)果

        持續(xù)灌胃6周后得到血液學(xué)和生化指標(biāo)測定結(jié)果見表3和表4。

        由表3可見,通腎顆粒給藥6周后對(duì)高、中、低和對(duì)照組雄性大鼠和雌性大鼠的紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和白細(xì)胞總數(shù)的差異均不顯著(P>0.05)。

        表3 給藥6周后對(duì)各劑量組大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

        由表4可見,通腎顆粒給藥6周后對(duì)高、中、低劑量組和對(duì)照組雄性大鼠和雌性大鼠的TP、ALT、BUN、AST、Cr、GLU、ALB均差異不顯著(P>0.05),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        停藥2周后血液學(xué)和生化指標(biāo)測定結(jié)果見表5和表6。

        由表5可見,通腎顆粒停藥2周后對(duì)高、中、低劑量組和對(duì)照組的雄性大鼠和雌性大鼠紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和白細(xì)胞總數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。

        表5 停藥2周后對(duì)各劑量組大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化

        由表6可見,通腎顆粒停藥2周后高、中、低劑量組和對(duì)照組雄性大鼠和雌性大鼠的ALT、AST、GLU、TP、ALB、BUN、CR差異均不顯著(P>0.05),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表6 停藥2周后對(duì)各劑量組大鼠生化指標(biāo)的影響

        2.3 大鼠臟器系數(shù)測定結(jié)果

        臟器系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可見,為期6周的灌胃,并沒有對(duì)大鼠的臟器系數(shù)造成影響。通腎顆粒對(duì)雄性與雌性大鼠的高、中、低劑量組、對(duì)照組的各個(gè)器官的臟器系數(shù)均沒有顯著差異(P>0.05),說明通腎顆粒在中長期試驗(yàn)中不會(huì)對(duì)大鼠的臟器產(chǎn)生負(fù)面作用。

        表7 通腎顆粒對(duì)各劑量大鼠臟器系數(shù)的影響

        2.4 病理學(xué)檢查結(jié)果

        試驗(yàn)結(jié)束,對(duì)3個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠剖檢后,分離采集其主要臟器,包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官,肉眼觀察無明顯的病理變化。分別取試驗(yàn)組和對(duì)照組中雌、雄大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官特征性組織部位,制成切片,置于顯微鏡下觀察,未發(fā)現(xiàn)各器官的病理變化。心肌纖維呈束,無斷裂;肝細(xì)胞無明顯腫大、壞死等變化;脾臟結(jié)構(gòu)清晰,無組織病變;肺臟結(jié)構(gòu)清楚,肺泡清晰可見;腎臟組織結(jié)構(gòu)正常,腎小球和腎小管形態(tài)正常,且間質(zhì)細(xì)胞未見增生現(xiàn)象(圖1)。

        圖1 大鼠病理組織學(xué)觀察

        3 討論

        亞慢性毒性是指人或動(dòng)物連續(xù)較長時(shí)間接觸較大劑量的化學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng),用以觀察較長時(shí)期毒性作用性質(zhì)和確定毒物的靶器官。本試驗(yàn)中,將通腎顆粒連續(xù)灌胃SD大鼠6周后,觀察各組大鼠的一般性指標(biāo)和生理生化指標(biāo),以及中毒癥狀、動(dòng)物體重變化、生活規(guī)律觀察、精神狀態(tài)、血液指標(biāo)與生化指標(biāo)檢測、尸檢、臟器系數(shù)、器官組織學(xué)檢查等。研究表明大鼠在持續(xù)服用通腎顆粒期間,生活規(guī)律、毛發(fā)、習(xí)慣、狀態(tài)、尿液、糞便等一般性指標(biāo)均無異常;血液指標(biāo)與生化指標(biāo)、體重變化、臟器系數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果為血常規(guī)、血液生化的數(shù)值各組差異不顯著(P>0.05),試驗(yàn)組和對(duì)照組體重存在顯著差異(P<0.01),臟器系數(shù)的數(shù)值各組差異不顯著(P>0.05)。綜合研究結(jié)果,表明通腎顆粒對(duì)大鼠的血液指標(biāo)、生化指標(biāo)和臟器無明顯影響。但若長期大量使用,會(huì)對(duì)雄性、雌性大鼠的生長造成一定的抑制作用。

        通腎顆粒亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,通腎顆粒對(duì)于SD大鼠的生活狀態(tài)、血常規(guī)和生化指標(biāo)以及內(nèi)臟器官等均無影響。表明該藥物毒性低,安全性高,在臨床上具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

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