李亞琳，史秀超，權(quán)美平

(渭南師范學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院， 陜西渭南 714099)

突觸分化誘導(dǎo)基因(synapse differentiation induced gene 1，SynDIG1)是一種高度保守的跨膜蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性突觸傳遞和突觸可塑性調(diào)節(jié)中起著重要的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)SynDIG1是α-氨基-3-羥基- 5-甲基-4-異惡唑丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazolpropionic acid，AMPA)受體上的調(diào)節(jié)蛋白，SynDIG1表達(dá)水平的改變會(huì)引起突觸中AMPA受體的明顯改變[2]。研究小組把神經(jīng)細(xì)胞從大鼠的海馬體神經(jīng)元中分離出來(lái)，經(jīng)過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SynDIG1和AMPA受體同時(shí)存在于突觸后膜，并在突觸形成的早期階段就已經(jīng)存在。SynDIG1可通過(guò)跨膜突觸調(diào)節(jié)分子調(diào)控突觸前蛋白，進(jìn)而影響突觸發(fā)育，還可以激活A(yù)MPA受體表達(dá)，通過(guò)胞吐作用將AMPA受體轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)突觸發(fā)育[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞中的SynDIG1表達(dá)水平，能夠改變突觸的數(shù)量和質(zhì)量。SynDIG1表達(dá)降低時(shí)，AMPA受體的數(shù)量減少，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體的傳遞速率降低，同時(shí)突觸變小，數(shù)量也會(huì)減少；反之，當(dāng)SynDIG1表達(dá)增強(qiáng)，會(huì)促進(jìn)AMPA受體的形成使其數(shù)量增加，NMDA受體的傳遞速率提高，突觸會(huì)更加成熟穩(wěn)定，這表明SynDIG1對(duì)突觸形成、發(fā)育以及壽命等有著至關(guān)重要的作用[4]。但是，SynDIG1促進(jìn)突觸發(fā)育和調(diào)節(jié)突觸可塑性的分子機(jī)制尚不明確。

隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，基因敲除和基因敲減技術(shù)的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。從最早的自殺質(zhì)粒，到RNA干擾以及鋅指核糖核酸酶技術(shù)，雖然現(xiàn)在也發(fā)展了CRISPR基因編輯技術(shù)，但基于慢病毒載體的shRNA基因敲減技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室研究中仍然被普遍應(yīng)用[5-6]。為了探索SynDIG1在突觸分化發(fā)育以及神經(jīng)傳導(dǎo)中的作用機(jī)理，本研究以人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的質(zhì)粒pLKO.1為載體，構(gòu)建靶向SynDIG1的shRNA，從而人為降低SynDIG1的表達(dá)量，為分析該蛋白在突觸分化以及可塑性調(diào)節(jié)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 從懷孕18 d的大鼠胚胎腦組織分離出海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)；HEK293T細(xì)胞,購(gòu)自空軍醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；PLKO.1-GFP質(zhì)粒、慢病毒包裝載體，美國(guó)Addgene Cambridge MA公司產(chǎn)品。

1.1.2 抗體和試劑 鼠抗Tubuin(1∶5 000)，美國(guó)Sigma-Aldrich，St.Louis，MO公司產(chǎn)品；鼠抗SynDIG1(蛋白印跡1∶1 000，免疫熒光1∶500)，英國(guó)Abcam Cambridge公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，(1∶5 000)，美國(guó)Bio-Rad,Hercules，CA公司產(chǎn)品；Alex Fluor 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶700)，美國(guó)Invitrogen，San Diego，CA公司產(chǎn)品。T4 DNA Ligase、AgeⅠ-HF、EcoRⅠ-HF、CutSmart、T4PNK Kinase、CIP，美國(guó)New England Biolabs，Ipswich，MA公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA公司產(chǎn)品；PEI質(zhì)粒提取試劑盒，美國(guó)Sigma-Aldrich，St.Louis，MO公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 冷凍高速離心機(jī)(5810R)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR儀器(T100 Thermal Cycler,CA)、凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000，MA)、生物安全柜(1300 A2)，美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(力康HealForce,HF90)；倒置熒光顯微鏡(CKX41)，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)細(xì)胞元代培養(yǎng) 懷孕18 d的大鼠，取其胚胎并分離腦皮質(zhì)和海馬組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。組織先用含有木瓜蛋白酶的Hanks平衡緩沖液在37 ℃消化15 min，然后用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)配制的包含1 mg/mLDNA酶、10 mg/mL卵脂黏蛋白、10 g/L牛血清白蛋白的研磨緩沖液研磨，直到神經(jīng)元完全分離。分離的海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)并接種于提前用多聚賴氨酸包被的60 mm培養(yǎng)皿或6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。初分離的細(xì)胞用包含100 mL/L胎牛血清(Atlanta Biologicals，F(xiàn)lowery Branch，GA，USA)、50 mL/L馬血清、60 mg/L的L-半胱氨酸，10 mg/mL青霉素/鏈霉素(Corning，Corning，NY，USA)和60 mg/L L -谷氨酰胺的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞接種的第2天更換包含10 mL/L馬血清、20 mL/L胎牛血清、10 mg/mL青霉素/鏈霉素和60 mg/L L-谷氨酰胺的DMEM營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，之后3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，直到細(xì)胞被用。

1.2.2 shRNA設(shè)計(jì) GenBank查到大鼠SynDIG1基因mRNA序列，用siRNA Wizard v3.1(Invivogen,San Diego,CA)找出靶點(diǎn)序列并設(shè)計(jì)1對(duì)21-mer的SynDIG1 shRNA序列(下劃線部分)，根據(jù)pLKO.1的shRNA Oligos設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出1對(duì)引物，引物序列如圖1所示，5＇端設(shè)計(jì)有AgeⅠ (CCGG)和EcoRⅠ(AATT)酶切位點(diǎn)以便克隆到pLKO.1-GFP載體上。

圖1 靶向SynDIG1的shRNA Oligos引物(下劃線為shRNA序列)Fig.1 Sequences of shRNA Oligos targeting SynDIG1(underline shows shRNA sequence)

1.2.3 載體構(gòu)建 合成好的Oligos用ddH2O溶解成100 μmol/L,2條引物進(jìn)行退火，反應(yīng)體系如下：正向反向引物各1 μL，10×NE buffer 5 μL， ddH2O 43 μL,共50 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min;70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20 ℃各30 min，最后16 ℃終止反應(yīng)。得到的退火產(chǎn)物用PNK進(jìn)行末端磷酸化，反應(yīng)體系：T4PNK Kinase 1 μL,10×T4DNA Ligase buffer(含ATP)5 μL，退火產(chǎn)物50 μL，共56 μL體系在37 ℃反應(yīng)1 h。

質(zhì)粒PLKO.1-GFP用AgeⅠ-HF、EcoRⅠ-HF和Cut Smart 37 ℃反應(yīng)1 h進(jìn)行消化，然后用CIP 37 ℃ 30 min進(jìn)行去磷酸化阻止質(zhì)粒自連。得到的產(chǎn)物進(jìn)行8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，切下7 kb的大片段用QIAGEN凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，用ddH2O溶解并調(diào)整溶度到100 ng/μL。

處理好的shRNA和質(zhì)粒PLKO.1-GFP進(jìn)行連接反應(yīng)。體系如下：PLKO.1-GFP消化產(chǎn)物 0.7 μL，oligo退火產(chǎn)物4 μL，T4Ligase 1 μL，10×T4DNA Ligase buffer(含ATP) 2 μL，ddH2O 12.3 μL，共20 μL，室溫反應(yīng)90 min。同時(shí)做一個(gè)不加shRNA的陰性對(duì)照。

1.2.4 重組克隆子篩選 取出-80 ℃凍存的感受態(tài)菌DH5α(40 μL分裝)，冰上融化后，加入20 μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻置冰上20 min，42 ℃ 熱激1 min，快速置于冰上冷卻2 min，加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基400 μL，37 ℃、200 r/min搖床上旋轉(zhuǎn)1 h使細(xì)菌復(fù)蘇，所有的轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂于預(yù)熱的含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)18 h。

1.2.5 DNA測(cè)序 挑選陽(yáng)性克隆子重懸于3 mL的LB培養(yǎng)液37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，QIAGEN試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提并測(cè)定DNA濃度。用25 pmol的PLKO.1通用引物和重組質(zhì)粒約800 ng共15 μL體系進(jìn)行測(cè)序。對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行培養(yǎng)并抽提其質(zhì)粒DNA。

1.2.6 病毒包裝 用pLKO.1 慢病毒包裝載體pLP1、pLP2、pLP VSV-G以及質(zhì)粒pLKO.1-GFP(對(duì)照)和pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，用DMEM和轉(zhuǎn)染試劑PEI轉(zhuǎn)染48 h，收集上清15 mL，1 200 r/min 5 min離心去除細(xì)胞殘?jiān)?，PEG 4 ℃過(guò)夜沉淀病毒，5 mL PBS溶解病毒并分裝保存于-80 ℃。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和感染 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒，轉(zhuǎn)入重組pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA到細(xì)胞進(jìn)行功能驗(yàn)證，HEK293T細(xì)胞在70%～80%飽和度時(shí)轉(zhuǎn)染，海馬神經(jīng)細(xì)胞在DIV11(daysinvitro)時(shí)轉(zhuǎn)染。將目的DNA和轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine分別與50 μL的OPTI-MEM混合后靜置5 min，DNA和轉(zhuǎn)染試劑比例為1 μg∶1 μL，然后將這兩者混合室溫孵育20 min?？傮w積約100 μL的混合液加到細(xì)胞中，十字晃動(dòng)孔板混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4 h后，用預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基替換掉轉(zhuǎn)染試劑，繼續(xù)培養(yǎng)。

包裝好的慢病毒重組病毒顆粒從冰箱取出后室溫放置10 min，徹底融化后直接加入孔板原代培養(yǎng)的DIV14或DIV2的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，200 μL/孔，24 h后換上新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7、9、12 d。

1.2.8 免疫印跡 HEK293T細(xì)胞以1×105個(gè)/ 孔接種于6孔板，第2天用pLKO.1-GFP和HA-SynDIG1(對(duì)照組)以及 pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA 和HA-SynDIG1(試驗(yàn)組)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染24 h。原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞分別加入之前包裝好的Lentivirus，分別感染7、9、12 d。

處理結(jié)束后提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)膜。用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。第2天取出膜，洗凈后加入HRP標(biāo)記的IgG二抗(1∶4 000),室溫雜交1 h。加入ECL顯色， 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.9 免疫熒光化學(xué) DIV11海馬神經(jīng)細(xì)胞用Lipofectamine 2000試劑分別轉(zhuǎn)染pLKO.1-GFP和pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA 48 h。用冰冷的ACSF(artificial cerebrospinal fluid)清洗2次，在40 mg/mL多聚甲醛溶液中室溫固定10 min，然后用3 mL/L Triton X-100滲透細(xì)胞膜10 min，PBS洗3次，100 mg/mL羊血清封閉1 h，加入SynDIG1一抗4 ℃孵育過(guò)夜。第2天取出細(xì)胞，用PBS洗滌后，再與Alexa594標(biāo)記的熒光二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌后用抗淬滅試劑封片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中SynDIG1的表達(dá)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA重組質(zhì)粒的獲得

pLKO.1-GFP用AgeⅠ-HF和EcoRⅠ-HF消化后，得到7 kb和1.9 kb的2個(gè)片段(圖2)。7 kb片段純化后與退火的SynDIG1 shRNA連接，得到5個(gè)陽(yáng)性克隆子，測(cè)序后有3個(gè)提前終止反應(yīng)，其余2個(gè)序列正確。

圖2 用AgeⅠ-HF和EcoRⅠ-HF消化pLKO.1-GFP

2.2 重組質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中抑制外源SynDIG1的表達(dá)

HEK293T細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞，插入SV40 T-抗原的溫度敏感基因后產(chǎn)生的高轉(zhuǎn)染效率的衍生株，本身并不表達(dá)SynDIG1。用序列正確的2個(gè)陽(yáng)性pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA質(zhì)粒與HA-SynDIG1共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后檢測(cè)SynDIG1在其中的瞬時(shí)表達(dá)。如圖3所示，可以看到2個(gè)重組質(zhì)粒都能敲減外源SynDIG1的表達(dá)，質(zhì)粒1敲減率為38.2 %，而質(zhì)粒2敲減率為74.8 %。與對(duì)照比較，兩個(gè)質(zhì)粒對(duì)SynDIG1表達(dá)的敲減差異均極顯著(P<0.01)。

A.SDS-PAGE;B.表達(dá)量；**P<0.01A.SDS-PAGE;B.Expression level；**P<0.01

2.3 重組質(zhì)粒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中SynDIG1表達(dá)的抑制

用重組質(zhì)粒2轉(zhuǎn)染DIV11神經(jīng)細(xì)胞48 h，然后進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)SynDIG1的表達(dá)。如圖4所示，pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA重組質(zhì)粒能夠敲減神經(jīng)細(xì)胞中SynDIG1的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞胞體中SynDIG1敲減率達(dá)到46.6 %，具有極顯著差異(P<0.01)；而在細(xì)胞樹(shù)突，其敲減率為28.7%，具有顯著差異(P<0.05)。

A.免疫熒光染色;B.表達(dá)量A.Immunofluorescence staining;B.Expression level

2.4 SynDIG1 shRNA慢病毒感染對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中SynDIG1表達(dá)的影響

用包裝好的慢病毒顆粒分別感染DIV2和DIV14神經(jīng)細(xì)胞，試驗(yàn)隨機(jī)選擇的感染時(shí)間為7、9、12 d。由圖5可以看出病毒感染后，SynDIG1的蛋白表達(dá)明顯降低，而且DIV2細(xì)胞中SynDIG1蛋白敲減率明顯高于DIV14細(xì)胞，達(dá)到75%以上。

A.SDS-PAGE;B.表達(dá)量A.SDS-PAGE;B.Expression level

3 討論

通過(guò)RNA干擾或RNA沉默進(jìn)行基因敲除或敲減是研究基因功能的一種常用方法。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNA干擾(RNAi)或RNA沉默可以通過(guò)瞬時(shí)siRNA(small or short interfering RNA)轉(zhuǎn)染或通過(guò)穩(wěn)定的shRNA (short hairpin RNA)導(dǎo)入來(lái)實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)有很多載體可以高效攜帶shRNA，而慢病毒載體是一種常用的shRNA運(yùn)載工具，可以將shRNA帶到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，能夠感染神經(jīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞等大多數(shù)細(xì)胞，具有基因片段容量大，免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[7,8]。另外，作為載體的病毒一般都是缺陷型的，因此不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，被感染的細(xì)胞也能夠連續(xù)傳代增殖[9]。

Addgene公司開(kāi)發(fā)的pLKO.1具有抗嘌呤霉素基因，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行選擇，也有助于陽(yáng)性克隆子的篩選，并且可以通過(guò)適當(dāng)?shù)陌b產(chǎn)生慢病毒顆粒[10]。含有shRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，可與靶基因序列結(jié)合，阻止基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。經(jīng)包裝得到的慢病毒微粒感染細(xì)胞后，將shRNA序列引入到宿主細(xì)胞染色體，穩(wěn)定表達(dá)發(fā)卡RNA，從而沉默靶基因的表達(dá)[11]。慢病毒載體因其穩(wěn)定性較好而被廣泛用于基因功能的研究中，而且基于 pLKO.1質(zhì)粒載體建立的shRNA數(shù)據(jù)庫(kù)也在逐漸擴(kuò)大，這些資源為科學(xué)家研究特定基因的功能及其與其他基因的相互作用提供了有力的工具。

本研究以pLKO.1-GFP為載體構(gòu)建了pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA，得到的陽(yáng)性克隆子在測(cè)序過(guò)程中，有3個(gè)提前終止，說(shuō)明載體本身純度不夠，最終僅得到兩個(gè)正確的SynDIG1 shRNA。這些SynDIG1 shRNA不僅能夠敲減HEK293T細(xì)胞中人為轉(zhuǎn)入的外源SynDIG1的表達(dá)，也能夠減少大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中內(nèi)源性SynDIG1的表達(dá)，其敲減率達(dá)到了75 %。同時(shí)，用pLP1、pLP2、pLP VSV-G這3種包裝質(zhì)粒對(duì)pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA包裝后形成的慢病毒，也能夠有效并穩(wěn)定的降低神經(jīng)細(xì)胞中固有SynDIG1的表達(dá)，而且病毒感染時(shí)間越早，內(nèi)源性SynDIG1的敲減效率也越高。本試驗(yàn)中DIV14神經(jīng)細(xì)胞感染pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA慢病毒顆粒后，SynDIG1蛋白的敲減程度明顯低于DIV2，這是因?yàn)镈IV14神經(jīng)細(xì)胞在病毒感染之前就已經(jīng)產(chǎn)生了SynDIG1蛋白，并且在神經(jīng)細(xì)胞中積累，在突觸發(fā)育的早期發(fā)揮作用。而病毒感染只能阻止SynDIG1基因的轉(zhuǎn)錄，不能影響已經(jīng)形成的SynDIG1蛋白，從而使DIV14神經(jīng)細(xì)胞中檢測(cè)到的SynDIG1蛋白增加。通過(guò)利用HEK293T以及大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞所做的試驗(yàn)，證明了本研究得到的重組pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA能夠有效并穩(wěn)定地敲減外源性以及內(nèi)源性SynDIG1靶基因的表達(dá)。

本研究用pLKO.1-GFP作為載體，成功構(gòu)建了靶向SynDIG1的pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA，該重組質(zhì)粒以及包裝后的慢病毒均能夠有效地抑制內(nèi)源性及外源性SynDIG1的表達(dá)，為SynDIG1的功能研究提供一個(gè)有力的工具，也為基于慢病毒載體的其他基因的shRNA載體構(gòu)建提供了參考方法。