田城城，蘭文升，吳 江，溫智清，葉仕根，史衛(wèi)軍

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023；2.深圳海關(guān)動植物檢驗檢疫技術(shù)中心/深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院， 廣東深圳 518010)

海虱是一種以許多海洋魚類為宿主的體外寄生蟲，分類上屬于橈足亞綱(Copepoda)，魚虱科(Caligidae)[1]。該寄生蟲共有10個發(fā)育階段，每個階段都由一次退殼完成生長，包括2個浮游的無節(jié)幼體階段，1個具有感染性的橈足類階段，4個由額絲連接到宿主的甲殼階段，2個成年前階段和1個成年階段[2-3]。海虱主要寄生在鮭科魚類身上，這種寄生蟲會影響宿主的生長、繁殖和生存，主要以宿主的黏液和表皮細胞為食，造成魚體體表出血和潰瘍、免疫力和應(yīng)激能力下降、游動能力受損，嚴重時可以導(dǎo)致宿主死亡[4]。研究表明，最容易受到感染的動物是海鱒(S.trutta)和大西洋鮭(S.salar)，其次是虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、銀大麻哈魚(Oncorhynchuskisutch)和粉紅三文魚(O.gorbuscha)等[5-7]，在海水養(yǎng)殖的大西洋鮭魚，特別是高密度養(yǎng)殖，海虱是造成其他多種疫病暴發(fā)的一個原因。近年來，世界許多地區(qū)的鮭魚養(yǎng)殖業(yè)受到嚴重影響，在全球養(yǎng)殖業(yè)中，由于海虱感染引起的直接和間接年度損失估計超過1億美元[8]，包括蘇格蘭、挪威、美國、加拿大等地。在我國沿海很多省開始在海岸線發(fā)展養(yǎng)殖大西洋鮭魚產(chǎn)業(yè)，內(nèi)陸地區(qū)也已經(jīng)大規(guī)模淡水養(yǎng)殖虹鱒魚，這些都是海虱的易感動物。目前，在我國還沒有海虱感染養(yǎng)殖魚的報道，但是，每年進口我國的大西洋鮭魚超過3萬噸，這些進口鮭魚如果攜帶海虱，很容易對我國鮭科魚養(yǎng)殖行業(yè)造成潛在經(jīng)濟損失，因此，入境口岸必須建立檢驗檢疫程序，嚴格篩查和鑒定進口鮭魚是否攜帶外來物種海虱，以便采取防止外來物種入侵的防控措施。

目前，對于海虱的鑒定主要側(cè)重于形態(tài)學(xué)，魚虱科的物種形態(tài)相似，其部分結(jié)構(gòu)肉眼難以辨別，需要借助解剖鏡或者電鏡等工具，且個體形態(tài)還受到環(huán)境因子、種類個體變異、雌雄個體差異以及發(fā)育時期等因素的影響[9]，蟲卵和早期發(fā)育狀態(tài)的幼蟲無特定形態(tài)特征，單純的形態(tài)特征難以檢出魚虱和判定物種類別。18S rDNA具有高度保守性的特點，該基因序列差異大小代表了物種差異大小，大量的研究表明18S rDNA在物種分類鑒定、系統(tǒng)進化關(guān)系等領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用其來確定物種的分類地位[10]。而迄今為止海虱的分子生物學(xué)鑒定方面的研究較少，主要在單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)、微衛(wèi)星遺傳標記[11-13]等方面有所報道。核酸體外擴增技術(shù)能夠通過獲得的遺傳物質(zhì)實現(xiàn)對檢測對象的識別，PCR擴增18S rDNA，測序后比較物種間的差異，是病原學(xué)檢測鑒定中的常用方法。實時熒光PCR則通過熒光基團標記的特異性探針，可以對PCR擴增過程實時監(jiān)控以及對產(chǎn)物進行數(shù)字化分析，監(jiān)測目標核酸擴增情況，該方法相比普通的PCR和常規(guī)形態(tài)學(xué)方法，具有耗時短的特點，良好的特異性和高靈敏度是病原篩查的優(yōu)選技術(shù)，在物種鑒定領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。本研究擬對進口大西洋鮭魚攜帶的海虱成蟲開展形態(tài)學(xué)研究，進一步做分子生物學(xué)分析，建立口岸檢驗檢疫快速和實用的鑒定方法，嚴密監(jiān)控外來海虱入侵我國。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海虱 2017年1月-2019年8月，深圳海關(guān)病毒與免疫檢驗檢疫實驗室截獲的347只海虱，均是從挪威進口的大西洋鮭魚體上采集，并存放于-20℃待檢。

1.1.2 試劑 DNA標準DL 2 000、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)、T 載體、DNA 凝膠回收試劑盒、MiniBEST Plasmid Purification Kit等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen公司產(chǎn)品；瓊脂糖H，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 M450C顯微成像系統(tǒng)，德國蔡司公司產(chǎn)品；熱循環(huán)PCR儀器、微量核酸蛋白濃度分析儀(Nanodrop 2000C)，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；實時熒光PCR儀(7500型)，ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 海虱通常定植在大西洋鮭魚的體表鱗片上或者鰓絲上，將從魚體上采集的海虱置于培養(yǎng)皿中，加少量生理鹽水，置于體視顯微鏡下，觀察試驗樣本的外部形態(tài)特征，并使用M450C顯微成像系統(tǒng)對其進行拍照記錄，其形態(tài)學(xué)鑒定標準參考Johnson S C等[14]對海虱形態(tài)發(fā)育的描述。

1.2.2 PCR鑒定

1.2.2.1 目的基因的擴增及電泳分析 在NCBI上獲取19種海虱的18S rDNA序列，通過多序列比對，在保守區(qū)域設(shè)計擴增引物。使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取所有海虱樣品的基因組DNA，保存于-20 ℃。以樣品的基因組DNA為模板，以SL18S-F和SL18S-R引物對海虱的18S rDNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系包括2×PCR buffer 12.5 μL，20 μmol/L的SL18S-F、SL18S-R引物各1 μL，最后加DEPC水及模板補足25 μL。反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察反應(yīng)結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送至華大基因公司進行測序。

1.2.2.2 序列比對 使用DNA Star對擴增的18S rDNA序列進行序列比對，一般認為序列同源性為99%以上認定為一種。并根據(jù)P-距離計算序列的變異程度，序列變異在1%以內(nèi)，則認定為同一種。參考GenBank序列數(shù)據(jù)庫(表1)，通過序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對寄生蟲做確證鑒定。

表1 PCR擴增引物設(shè)計和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參考序列

1.2.2.3 基于18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析 將樣品測序后得到的樣品的18S rDNA序列與19種已發(fā)表的分屬于5個屬的魚虱科物種的18S rDNA基因序列一起構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并選取Anthosomacrassum為外類群。用MEGA7.0軟件鄰接法(Neighbor joining，NJ)基于Kimura2-Prameter方法計算遺傳距離值，計算Bootstrap值，重復(fù)1 000次，構(gòu)建基于18S rDNA序列的分子進化樹。

1.2.3 實時熒光PCR鑒定

1.2.3.1 引物與探針的設(shè)計 通過對比海虱的18S rDNA基因序列，選取堿基序列差異較小的位點，利用Oligo軟件設(shè)計一對特異性引物和一條探針，由華大基因生物有限公司合成(表2)。

表2 本試驗中所用的引物和探針序列

1.2.3.2 標準品的制備 以PCR擴增鮭瘡痂魚虱的18S DNA基因序列，將擴增產(chǎn)物的基因片段進行純化回收，純化產(chǎn)物與pMD18-T載體4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5α中，經(jīng)鑒定后將陽性菌液送至金維智生物有限公司測序驗證，測序正確的菌株用于提取質(zhì)粒，制備質(zhì)粒標準品。重組質(zhì)粒濃度并按公式：模板拷貝濃度(拷貝/μL)=重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度(mg/L)×6.02×1014/(660×重組質(zhì)粒堿基數(shù))。

1.2.3.3 標準曲線的建立 利用微量核酸蛋白濃度分析儀測定質(zhì)粒標準品濃度，將其10倍梯度稀釋，作為已知濃度的標準品進行實時熒光PCR反應(yīng)繪制標準曲線。反應(yīng)體系為2×premix ExTaq(Probe qPCR) 10 μL，20 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL、探針0.8 μL，ROXⅡ 0.5 μL，加入模板和水補足25 μL。反應(yīng)程序第一步：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；第二步：95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40個循環(huán)。同時做3個平行樣，測定靈敏度并計算標準曲線。

1.2.3.4 海虱樣品的實時熒光PCR鑒定 以1.2.1中保存的所有海虱核酸樣品作為模板，按照前述反應(yīng)體系和程序進行實時熒光PCR，用于檢測該方法的實用性。

2 結(jié)果

2.1 海虱的形態(tài)學(xué)鑒定

從進口大西洋鮭魚體上收集到347個海虱樣品均為成蟲形態(tài)，使用體視顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有如下特征：蟲體大致可以分為頭胸部、腹部和尾部3個部分(圖1A～G)。

A.背部;B.腹部;C.雌性;D.雄性 ;E.頭胸部的腹面;F.雄性的腹部和尾部;G.雌性的腹部和尾部;1.第一觸角;2.第二觸角;3.第一顎足;4.口器;5.胸叉;6.第四胸足;7.第二胸足;8.第五胸足;9.尾叉;10.尾剛毛;11.生殖節(jié);12.卵串;13.卵A.Back;B.Abdomen;C.The female;D.The male;E.Ventral part of cephalothorax;F.Abdomen and tail of male;G.Abdomen and tail of female;1.First antenna;2.Second antenna;3.First maxilliped;4.Mouthpart;5.Chest fork;6.The fourth leg;7.The second leg;8.The fifth leg;9.Caudal rami;10.Caudal rami setae;11.Genital segment;12.Egg strings;13.Eggs

頭胸部形態(tài)扁平，呈盾狀，頭與前3個胸節(jié)愈合并覆以胸甲，第4胸節(jié)沒有覆蓋胸甲，第1和第2觸角具有鄂鉤，并附有觸毛；第1和第2顎足尖端似爪，具有抓握作用，能夠牢固附著在魚體，第4對胸足異常發(fā)達，協(xié)助蟲體運動。腹部僅有一節(jié)且寬度和長度均小于頭胸部，第5胸足與生殖節(jié)愈合。尾部具有一節(jié)，末端分為2個尾叉，每個尾叉有4根尾剛毛。成蟲形態(tài)特征明顯分兩類，經(jīng)鑒別為性別差異，雌性腹部生殖節(jié)呈圓柱形，長度和寬度相差不大，具有狹窄傾斜的前外側(cè)邊緣，部分個體還帶有2條卵串(圖1 C)；雄性的腹部生殖節(jié)的寬度小于長度，呈卵圓型，第5對胸足有4根剛毛，位于節(jié)段中間靠近側(cè)緣的位置(圖1D)。所有樣品總體符合鮭瘡痂魚虱發(fā)育階段成蟲時期的形態(tài)特征的描述，初步判斷從大西洋鮭魚所截獲樣品為典型的海虱。但是，除了上述顯著特征差異，所截獲的海虱在個體形態(tài)、發(fā)育階段和色素沉積上仍然有一些較大的差異，所有樣品是否屬于同一類，形態(tài)學(xué)方法難以直接判斷其種屬，因此，需要借助分子生物學(xué)手段來進一步做類屬分析。

2.2 PCR鑒定

2.2.1 PCR擴增 根據(jù)數(shù)據(jù)庫中海虱的序列設(shè)計引物，進行PCR擴增，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，進口大西洋鮭魚攜帶的所有海虱樣品均能擴增出1條明亮清晰大小約為1 700 bp的條帶，與預(yù)計PCR產(chǎn)物大小一致，且條帶單一(圖2)。表明本試驗所設(shè)計的引物能對采集樣品的18S rDNA片段得到有效擴增，然后將所有擴增產(chǎn)物測序分析。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照;2～11.部分海虱樣品M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2-11.Partial samples of sea lice

2.2.2 多序列比對及Blast比對 使用MegAlign軟件分別對347個樣品獲得的測序序列進行多序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中286個樣品序列完全一致，其余61個樣品序列完全一致，歸類為序列1和序列2兩類，其結(jié)果如圖3所示，兩類序列共有65個堿基變異位點，序列間總相似度為96.01%。分別將兩類序列在GenBank進行Blast比對，結(jié)果顯示，序列1和序列2分別與鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirussalmonis,LS)和長魚虱(Caliguselongatus,CE)具有最高同源性。

陰影部分表示序列之間差異位點The shadow parts indicate the different sites between the sequences

2.2.3 基于18s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 將兩類海虱的18S rDNA序列和在NCBI上獲得的19種海虱的18S rDNA序列構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明，本研究通過PCR擴增獲得的序列1和序列2的分別與鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirussalmonis)和長魚虱(Caliguselongatus)聚為一簇，分屬于魚虱科的不同屬。在進化樹中屬于同一科的物種聚于同一大支，每個科中同一屬聚于同一分支，在進化樹中可以體現(xiàn)出不同科、屬的進化關(guān)系。表明來自于挪威的進口大西洋鮭魚受到兩種海虱的感染，主要是鮭瘡痂魚虱，占截獲樣品總數(shù)的82.42%，另一類病原為長魚虱，占截獲樣品總數(shù)的17.58%。兩類都是在我國沒有報道的寄生蟲類群，為典型的外來物種。

圖4 基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 實時熒光PCR鑒定

重組標準品質(zhì)粒通過公式計算得知濃度為3.2×107拷貝/μL，經(jīng)10倍梯度稀釋后，以2.94×100拷貝/μL～2.94×107拷貝/μL的重組質(zhì)粒為擴增模板進行實時熒光PCR擴增，不同濃度梯度重組質(zhì)粒的擴增曲線見圖5，在40個循環(huán)內(nèi)最低檢出濃度為2.94拷貝/μL；以起始模板濃度的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標自動生成的標準曲線見圖6，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為:y=-3.33logx+35.38，由此可見，模板濃度與Ct值之間存在較好的線性關(guān)系，該方法具有良好的重復(fù)性和靈敏度。

1～8.2.94×107拷貝/μL的標準品質(zhì)粒～2.94×100拷貝/μL的標準品質(zhì)粒1-8.2.94×107 copy/μL-2.94×100 copy/μL

圖6 標準品的標準曲線

用建立的實時熒光PCR對所有樣品的核酸鑒定，無論鮭瘡痂魚虱還是長魚虱樣品均能夠得到陽性結(jié)果(圖7)，與PCR鑒定結(jié)果一致，表明建立的快捷檢測方法對兩類海虱都能夠有效檢出。當(dāng)樣品為無明顯形態(tài)特征的蟲卵或者幼蟲時，由于具有很高的靈敏性，有效降低漏檢率，且整個過程操作簡單，耗時短，僅需70 min即可完成，可以使用該方法作為初篩技術(shù)，檢測結(jié)果為陽性的樣品可以進一步做測序鑒定，是PCR的有效替代技術(shù)。

1.陽性對照;2.LS樣品;3.CE樣品;4.陰性對照1.Positive control; 2.LS sample; 3.CE sample; 4.Negative control

3 討論

本研究首次報道進口大西洋鮭魚有攜帶外來物種海虱入境的風(fēng)險。海虱是一種橈足類海水動物寄生蟲，主要分布于北大西洋和北太平洋的野生和養(yǎng)殖的大西洋鮭魚上，尤其鮭瘡痂魚虱，給大西洋鮭魚養(yǎng)殖場造成了巨大的經(jīng)濟損失。如何控制海虱感染鮭魚已被水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)列為首要任務(wù)之一[15]。本研究鑒定了來自于挪威的大西鮭魚上寄生的海虱，鑒定結(jié)果顯示魚體攜帶有兩種海虱，分別是鮭瘡痂魚虱和長魚虱，其中占比較高的物種是鮭瘡痂魚虱。且在18S DNA水平上，無論是鮭瘡痂魚虱還是長魚虱都未出現(xiàn)分型，與基于CO1分型研究的結(jié)果一致[16]。Stone J等[17]報道了在挪威海域的確分布有這兩個海虱，并且在蘇格蘭地區(qū)對這2種海虱開展過防治研究。根據(jù)Treasurer J W等[18]的描述，鮭瘡痂魚虱主要侵染大西洋鮭魚的頭部和背部，而長魚虱主要在腹鰭和尾部有較高的比例，并不存在太大的寄生空間競爭，因此，這兩個物種可以共同生存在同一個體上，并都可以對大西洋鮭造成相同的病情。本研究收集的進口鮭瘡痂魚虱在形態(tài)上與我國黃、渤海發(fā)現(xiàn)的5種瘡痂魚虱較為相似，它們之間是否有相同的感染性目前還未知。我國目前正在大量淡水養(yǎng)殖虹鱒，而且沿海也已經(jīng)引種大西洋鮭，開始海洋養(yǎng)殖。雖然在國內(nèi)養(yǎng)殖的虹鱒上還未見海虱感染報道，但是，有報道1990年在臺灣的莫桑比克羅非魚上發(fā)現(xiàn)了與長魚虱同屬Caligusepidemicus[19]的寄生蟲感染，目前，來自于挪威大西洋鮭魚攜帶的2種海虱存在感染國內(nèi)養(yǎng)殖鮭鱒魚的風(fēng)險。根據(jù)時空分布特點和易感物種分析，海虱一旦侵入我國，將會對我國的海水鮭魚養(yǎng)殖業(yè)造成損失，因此，識別和監(jiān)控外來海虱入侵至關(guān)重要。

本研究獲得的樣品均為成蟲，但海虱有10個發(fā)育階段，每個階段形態(tài)差異都較大，在成年前期Ⅰ，雌雄個體還有極大差別[2]。海虱蟲體較小，成蟲體長約為6 mm～11 mm，使用肉眼和普通顯微鏡難以辨識。在進口大西洋鮭魚的魚體上有可能攜帶蟲卵或者正處于甲殼階段的幼體，這些階段的海虱個體小，形態(tài)差異大，如果僅用形態(tài)學(xué)方法篩查，存在遺漏的風(fēng)險，本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定和輔以分子生物學(xué)手段，能在基因水平篩查和鑒定海虱屬種。本研究基于18S rDNA基因序列建立的實時熒光PCR方法，最低檢測為2.94拷貝/μL，耗時短，僅需70 min即可完成檢測，能夠快捷地鑒定海虱，可以作為一種快速的初篩方法，設(shè)計的引物和探針對兩種海虱有相同的擴增效率，可以同步篩查兩種海虱。與Jonhard E等[20]基于圓鰭魚(Cyclopteruslumpus)線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ(COI)建立檢測胃液中的鮭瘡痂魚虱實時熒光PCR相比，針對性更強，靈敏度更高。建立的PCR，配合測序技術(shù)，可以精準鑒定海虱的類屬，為預(yù)警進口大西洋鮭魚上攜帶的海虱入侵我國提供了實用的鑒定方法和技術(shù)支持。