毛暢思，黨 喬，魏 星，孔令聰,3*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100093；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；3.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；4.遼源市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林遼源 136220)

牛呼吸系統(tǒng)疾病(Bovine respiratory disease，BRD)已成為制約肉牛養(yǎng)殖的主要因素，危害著世界各地養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年因BRD造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)3億美元，其中英國(guó)每年約有190萬(wàn)頭?；糂RD，死亡達(dá)15.7萬(wàn)頭[1]。在我國(guó)該病主要發(fā)生在經(jīng)外地引進(jìn)的育肥牛中，老百姓稱之為“爛肺病或運(yùn)輸熱”，其發(fā)病率高達(dá)80%，單場(chǎng)病死率高達(dá)60%[2]，給我國(guó)肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，部分養(yǎng)殖戶已不敢遠(yuǎn)距離運(yùn)牛。引發(fā)BRD的病原主要為牛支原體(Mycoplasmabovis)、牛多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)和溶血曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica,Mh)，且部分混合感染的病例發(fā)病率和病死率更高[3]。時(shí)至今日，該病的發(fā)生并未減緩，相關(guān)研究推測(cè)其主要病原可通過(guò)肉牛的異地轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)生傳播，而我國(guó)“北牛南調(diào)，西牛東運(yùn)”的肉牛育肥模式更為該病的發(fā)生和傳播提供了便利的條件[4]。某牛場(chǎng)經(jīng)異地引進(jìn)牛后，多頭牛發(fā)病，經(jīng)抗菌藥物治療后并未好轉(zhuǎn)，亟需對(duì)主要病原進(jìn)行分離鑒定并對(duì)其藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)。為此，本研究擬對(duì)某牛場(chǎng)運(yùn)輸后的患牛進(jìn)行主要病原的分離鑒定，對(duì)藥物敏感性、致病性進(jìn)行了檢測(cè)，進(jìn)一步對(duì)分離菌進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型，以對(duì)其主要病原是否發(fā)生克隆傳播進(jìn)行確證，為我國(guó)BRD的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)“北牛南調(diào)”的臨床健康牛鼻腔拭子12份；運(yùn)輸后發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病死亡病死牛2頭，無(wú)菌采集病死牛的心臟、肺臟和肝臟等臟器。

1.1.2 培養(yǎng)基與藥品 所需培養(yǎng)基，中國(guó)青島日水公司產(chǎn)品；PCR試劑、膠回收試劑等分子生物學(xué)試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺氯氰鈉、四環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、紅霉素、克林霉素、新諾明等藥品，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；部分藥品由康地恩生物有限公司惠贈(zèng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)小鼠，體重20 g～25 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀檢查 對(duì)運(yùn)輸后出現(xiàn)咳嗽、喘的病牛進(jìn)行臨床癥狀檢查。

1.2.2 病例剖檢 對(duì)運(yùn)輸后以咳嗽、喘為主要癥狀死亡的病牛進(jìn)行剖檢，觀察主要臟器的病理變化，進(jìn)一步制備病變較明顯臟器的病理組織切片。

1.2.3 細(xì)菌學(xué)檢查

1.2.3.1 分離培養(yǎng) 將采集的健康牛鼻腔拭子、病死牛肺臟接種于腦心浸液肉湯，置37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h后，再接種于腦心浸液固體培養(yǎng)基和鮮血瓊脂平板，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，菌落形態(tài)，以及是否發(fā)生溶血。同時(shí)，將病料無(wú)菌研磨后接種于改良的PPLO培養(yǎng)基，觀察其是否有牛支原體生長(zhǎng)。

1.2.3.2 生化及分子生物學(xué)鑒定 分離菌的生化鑒定按常規(guī)方法進(jìn)行。同時(shí)，采用16S rRNA引物和多殺性巴氏桿菌特異性引物kmt1及capA、capB、capD、capE、capF莢膜分型引物對(duì)疑似巴氏桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增及莢膜分型。

1.2.3.3 致病性試驗(yàn) 采用改良寇氏法對(duì)分離的3株P(guān)m進(jìn)行LD50的測(cè)定。每株菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度為104、105、106CFU/mL 3個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組隨機(jī)取8只小鼠，雌雄各半。每個(gè)劑量組腹腔注射不同梯度濃度菌液0.3 mL。每組小鼠隔離飼養(yǎng)，連續(xù)3 d觀察死亡情況，計(jì)算LD50值。

1.2.3.4 藥敏試驗(yàn) 采用2種方法對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)(微量肉湯稀釋法和平皿二倍稀釋法)。試驗(yàn)藥物為環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺氯氰鈉、四環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、紅霉素、克林霉素和新諾明等9種抗菌藥物。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。Pm的藥物敏感性判定折點(diǎn)見表1。

表1 Pm對(duì)部分抗菌藥物敏感性判定折點(diǎn)

1.2.3.5 PFGE分型 參考Ahmed M.Moustafa等的方法，結(jié)合Pm脈沖場(chǎng)凝膠電泳試驗(yàn)方法、步驟對(duì)這3株分離菌進(jìn)行分型[5]。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察

運(yùn)輸后共12頭牛發(fā)生咳嗽、氣喘等癥狀，食欲減退，反芻遲緩，體溫升高達(dá)40 ℃～42℃，但病牛未出現(xiàn)跛行等癥狀。

2.2 病理剖檢及切片觀察

剖檢可見肺臟病變最為明顯，肺臟廣泛出血，胸膜粘連，肺組織切面呈大理石樣，胸腔可見纖維素樣滲出。其他臟器未見異常。病理切片觀察可見支氣管及周圍肺泡腔內(nèi)腔充滿大量中性粒細(xì)胞(圖1A和圖1B)，肺泡腔擴(kuò)張，肺泡腔及細(xì)支氣管內(nèi)散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C和圖1D)，以中性粒細(xì)胞為主。間質(zhì)輕度增生。

A、B.100×；C、D.400×A,B.100×; C,D.400×

2.3 細(xì)菌學(xué)診斷

2.3.1 細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)特性 病死牛的肺臟、心血觸片瑞特染色鏡檢，可見兩極濃染的短桿菌，革蘭氏染色呈陰性。分離菌在腦心浸液培養(yǎng)基生長(zhǎng)較好，菌落呈半透明露滴狀；改良PPLO肉湯未見支原體生長(zhǎng)。

2.3.2 生化及分子生物學(xué)鑒定 3株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、單奶糖和甘露糖，靛基質(zhì)反應(yīng)陽(yáng)性，不能發(fā)酵鼠李糖、乳糖，V-P試驗(yàn)和H2S試驗(yàn)陰性。采用Kmt1引物對(duì)3株分離株進(jìn)行鑒定，得到460 bp的片段，結(jié)果如圖2所示，采用16S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到1 600 bp的目標(biāo)片段，將目的片段純化、連接、轉(zhuǎn)化、篩選并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用Blast軟件與GenBank已登錄序列進(jìn)行比對(duì)分析，其與Pm的同源性高達(dá)99%，結(jié)果如圖3所示；進(jìn)一步以3株P(guān)m抽提的基因組為模板，經(jīng)莢膜分型多重PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出1 000 bp左右的特異條帶，其大小與capA相符，PCR結(jié)果如圖4所示。因此可以判定分離的3株P(guān)m為莢膜A型Pm，分別編號(hào)為TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1～3.TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2；4.陽(yáng)性對(duì)照M.DNA Marker DL 1 000; 1-3.TL0501-1,HN0510-1,HN0510-2; 4.Positive control

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.capA陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3-5.TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2M.DNA Marker DL 2 000; 1.CapA positive control; 2.Negative control; 3-5.TL0501-1,HN0510-1,HN0510-2

2.3.3 小鼠致病性試結(jié)果 采用改良寇氏法測(cè)定了3株P(guān)m的LD50，TL0501-1 LD50為1.4×105，HN0510-1 LD50為2.2×105，HN0510-2 LD50為2.6×105。剖檢死亡小鼠，用瑞特染色鏡檢可見兩極濃染的短桿菌。

2.4 分離菌的藥物敏感性檢測(cè)及分析

采用微量肉湯稀釋法和平皿二倍稀釋法對(duì)分離菌進(jìn)行了常用藥物的敏感性檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，3株分離菌藥物敏感性相同，均對(duì)四環(huán)素、氟苯尼較敏感，對(duì)喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物已呈不同程度耐藥性。

表2 3株分離菌的MIC結(jié)果

2.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

將3株牛A型Pm基因組酶切后進(jìn)行PFGE電泳，根據(jù)條帶數(shù)和所在位置,3株分離菌具具有同一譜型，證明3株菌屬于同一克隆。

M.沙門氏菌H9812分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.分別為TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2M.Salmonella H9812 molecular weight Marker; 1-3.TL0501-1,HN0510-1 and HN0510-2,respectively

3 討論

近年來(lái)，隨著世界肉牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牲畜的異地運(yùn)輸已成為生產(chǎn)過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)，極大的提高了肉牛生產(chǎn)的效率，但育肥牛的運(yùn)輸作為一種壓力源，已引發(fā)了經(jīng)濟(jì)和動(dòng)物福利等多方面的擔(dān)憂[6-7]。其中，BRD已被認(rèn)為是經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)挠逝Ｖ卸喟l(fā)的疾病，與BRD和運(yùn)輸應(yīng)激之間的許多假設(shè)已被提出，相關(guān)研究認(rèn)為,育肥牛在運(yùn)輸過(guò)程中經(jīng)受的多重壓力導(dǎo)致了整體免疫水平的降低，使許多病原體趁機(jī)入侵，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8-9]。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)科研工作者已對(duì)運(yùn)輸后BRD展開了研究，在國(guó)外，引發(fā)該病的主要病原主要為牛支原體、牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌和睡眠嗜血桿菌等，其中混合感染病例較多[10-11]。我國(guó)BRD的主要病原與國(guó)外略有差異，在我國(guó)主要病原是牛支原體和多殺性巴氏桿菌，其他病原的混合感染并不多見[12]。本研究對(duì)某肉牛育肥場(chǎng)運(yùn)輸后的BRD進(jìn)行跟蹤調(diào)查，并對(duì)運(yùn)輸后健康牛鼻腔拭子和運(yùn)輸后因BRD死亡的2頭病牛進(jìn)行了剖檢和病原分離，共分離到3株牛莢膜A型Pm，3株分離菌不但具有較強(qiáng)的小鼠致病性，還均具有同一基因型，證明其隨著肉牛的運(yùn)輸發(fā)生了克隆傳播。該研究未分離到牛支原體和溶血曼氏桿菌。

多殺性巴氏桿菌引發(fā)疾病主要依賴抗菌藥物治療，但大量研究表明，隨著抗菌藥物的使用，不同國(guó)家和地區(qū)的分離菌已對(duì)臨床常用藥物呈現(xiàn)了不同的耐藥譜，為該菌引發(fā)疾病的治療造成了困擾[13-15]。為此，本研究對(duì)3株分離菌進(jìn)行了常用藥物的敏感性檢測(cè)，以期優(yōu)化臨床用藥方案，結(jié)果顯示分離菌耐藥譜相同，3株菌均對(duì)新諾明、磺胺氯氰鈉及克林霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星呈現(xiàn)了不同程度的耐藥性，僅對(duì)對(duì)替米考星、四環(huán)素和氟苯尼考較敏感。值得注意的是，該場(chǎng)分離菌已對(duì)喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生了抗性，而該2類藥物是獸醫(yī)臨床治療BRD的首選藥?？傊?，通過(guò)該研究證明引發(fā)BRD的主要病原可隨育肥牛的異地運(yùn)輸而發(fā)生傳播，為此建議在育肥牛運(yùn)輸之前，應(yīng)采用敏感藥物對(duì)BRD進(jìn)行預(yù)防性治療。根據(jù)引發(fā)BRD病原菌及其對(duì)臨床常用藥物產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，我們進(jìn)一步對(duì)該病主要病原菌進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，及時(shí)篩選出敏感藥物，已達(dá)到針對(duì)性治療的目的，防止因病原菌耐藥性產(chǎn)生而造成的抗感染失敗。