賀會利，謝永平*，龐彬輝，毛素梅，曾 飛

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西南寧 530001；3.廣西桂東靈長類開發(fā)實驗有限公司，廣西梧州 543100)

食蟹猴(machin)屬于靈長目(Primate)猴科(Cercopithecidae)獼猴屬(Macaca)。由于其遺傳基因與人類的遺傳基因相似度可達98.5%，同時具有體型較小、性格溫順等優(yōu)點，因此常被作為國內外重要的實驗動物研究模型[1]。隨著世界科學研究中對試驗結果的準確度要求不斷提高，對試驗用猴的需求增多的同時對質量的要求也越來越高，但一些國家限制了食蟹猴的出口，導致實驗動物的流通數(shù)量不斷減少，這加速了廣西食蟹猴養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。在各種疫病中，寄生被認為是最重要的問題[3]。食蟹猴感染寄生蟲后對自身造成了生理、生化以及免疫學指標的變化，對試驗結果的準確性造成一定的干擾，為了提高實驗猴質量和養(yǎng)殖場的經濟效益，必須加強對猴群寄生蟲的控制與凈化。

結腸小袋蟲(Balantioidescoli，B.coli)屬于纖毛蟲門、動基裂綱、毛口目、小袋蟲科、小袋蟲屬，1857年首次從人體的糞便中發(fā)現(xiàn)該蟲體[4]。B.coli發(fā)育的過程中有滋養(yǎng)體和包囊兩種形態(tài)。滋養(yǎng)體主要以橫二分裂法增殖，蟲體極易變形，在不利的環(huán)境中形成包囊，包囊可在室溫條件下存活2月之久[5]，包囊不易受環(huán)境壓力影響，是病原體的傳播階段。由于結腸小袋蟲產生蛋白水解酶，會損傷結腸黏膜，蟲體利用損傷部位侵入腸壁[6]，寄生在動物腸道，導致動物機體腹瀉、結腸充血、出血、潰瘍和穿孔等，結腸小袋蟲是一種危害較大的人畜共患寄生性原蟲，必須給予足夠的重視[7]。目前認為豬是主要的傳播源，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，可感染包括人在內的30多種動物，人感染后可造成腸道潰瘍，甚至可轉移至呼吸道、尿生殖道、盆腔等部位寄生，造成壞死性肺、尿道感染、子宮陰道炎癥、膀胱炎等[8]。

糞便檢查對于診斷寄生蟲病有著非常重要的意義，對糞便樣品進行人工鏡檢法是目前寄生蟲檢測常用的方法，但由于標本量多，鏡檢速度較慢，易對操作者造成眼疲勞，并且存在一定的生物安全問題，因此常規(guī)的糞便檢查方法亟待改善[9]。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，聚合酶鏈反應(PCR)因其較高的敏感性、特異性及能夠提供病原體在體內存在的直接證據(jù)，在其診斷中展示了廣闊的應用前景[10]。人們能直接從DNA分子水平上來對寄生蟲進行相關研究，從而避開了顯微鏡觀察的過程。因此，獲得高質量的總DNA就成為這些研究的必要前提。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集和處理 廣西地區(qū)食蟹猴飼養(yǎng)場新鮮的腹瀉猴糞樣品，采集后立即鏡檢，確定是否有結腸小袋蟲滋養(yǎng)體和包囊。

1.1.2 試劑 糞便基因組DNA提取試劑盒、通用型柱式基因組DNA提取試劑盒、蛋白酶K、酚、氯仿、異戊醇、2×TaqMasterMix (Dye)、DNA Marker DL 2000、磷酸鹽緩沖液(PBS)、TE緩沖液、十二烷基硫酸鈉(SDS)、酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)、無水乙醇，北京康為世紀生物科技有限公司產品；植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，上海捷瑞生物工程有限公司產品；BIOWEST凝膠瓊脂，GENE公司產品。

1.1.3 儀器 PCR儀，天根生化科技(北京)有限公司產品；凝膠成像系統(tǒng)，自Bio-Rad公司產品；超微量核酸蛋白分析儀，五洲東方公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank中已經發(fā)表的結腸小袋蟲序列(登錄號：MG837094.1)，利用Oligo7軟件設計PCR引物，具體引物信息見表1。引物由廣州華大基因科技有限公司合成。

表1 引物

1.2.2 糞便中結腸小袋蟲DNA的提取 應用3種不同的商品化的試劑盒，按照試劑盒說明書提取樣品中的DNA，經典酚-氯仿法參考李霞[11]等人的操作方法進行提取。每種方法每個樣品重復3次，提取的DNA置于-20℃保存，用于核酸含量以及分子檢測。

1.2.3 DNA含量的測定 采用核酸核酸蛋白分析儀分別對通用型柱式基因組DNA提取試劑盒，植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，糞便基因組DNA提取試劑盒和經典酚-氯仿法4種方法抽提的DNA含量進行測定，重復3次。

1.2.4 PCR擴增 以DNA為模板，應用上述PCR引物(xmc-F/xmc-R，本實驗室保存)進行PCR擴增，其PCR體系為25 μL，分別為2×TaqMasterMix 13 μL、ddH2O 7 μL、引物各1 μL、模板DNA 3 μL。PCR擴增反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.5 電泳及測序 將PCR擴增產物在15 g/L 的瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后將有目的條帶的PCR產物進行膠回收、克隆、測序，準確后用試劑盒進行提取質粒。

2 結果

2.1 核酸含量測定結果

采用核酸核酸蛋白分析儀分別對通用型柱式基因組DNA提取試劑盒，植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，糞便基因組DNA提取試劑盒和經典酚-氯仿法4種方法抽提的DNA含量進行測定，均值分別為25.6、32.9、42.05、12.3 ng/μL。

2.2 DNA電泳檢測結果

將PCR產物進行凝膠瓊脂電泳，如圖1所示，獲得了以下結果。

M.DNA標準DL 2 000；1.通用型柱式基因組DNA提取試劑盒；2.植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)；3.糞便基因組DNA提取試劑盒；4.經典酚-氯仿法；5.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000；1.Universal genomic DNA kit；2.Plant genomic DNA kit；3.Stool genomic DNA kit；4.The phenol-chloroform extraction method；5.Negative control

2.3 臨床應用結果

利用糞便抽提試劑盒對68份廣西地區(qū)采集的腹瀉糞便進行DNA提取，12份為結腸小袋蟲陽性，與鏡檢結果進行對比驗證，結果顯示兩者的符合率為100%(圖2)。

M.DNA 標準 DL 2 000；1～22.臨床樣品檢測編號；23.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000；1-22.Clinical samples；23.Negative control

3 討論

近年來隨著動物醫(yī)學和生物學的大力發(fā)展，對實驗猴的需求量增加，同時對其等級質量要求也在提高，廣西因其優(yōu)越的地理位置及環(huán)境，成為全國人工養(yǎng)殖量最多的食蟹猴養(yǎng)殖基地，對其但隨著試驗猴集約化養(yǎng)殖程度的提高，寄生蟲感染狀況也日益凸顯，食蟹猴感染寄生蟲后對自身造成了生理、生化及免疫學指標的變化，對試驗結果的準確性造成一定的干擾[12]。研究發(fā)現(xiàn)，試驗用猴結腸小袋蟲感染率為3.27%[13]。結腸小袋蟲感染動物機體后可使自身免疫力下降，導致結腸小袋蟲的大量繁殖，造成飼料的轉化率下降，并且容易繼發(fā)細菌或病毒感染，加重病情，嚴重時可致動物死亡，并傳播感染其他動物，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經濟損失。

在非損傷性取樣材料中，動物糞便作為分析樣品，提取其DNA進行遺傳分析和分子生態(tài)學研究具有較好的實際意義和應用價值[14]。自1992年糞便DNA分析技術逐步發(fā)展起來，發(fā)展了多種糞便DNA提取方法，也證實了糞便DNA分析技術的穩(wěn)定性和可行性[15]。但仍存在很多問題，首先，由于糞便材料的特殊性，糞便中動物細胞分布不均，糞便中DNA含量少，容易降解[16]，并且其成分比較復雜，含有大量末消化的食物殘渣、膽堿等雜質成分[17]，因糞便中干擾因素多，增加了樣品DNA的提取和基因擴增的難度，甚至增加基因分型的錯誤率等[18]。其次，物種和個體之間的差異導致各種提取方法通用性不好，致使試驗中存在擴增成功率低。再次，從糞便中提取總DNA的方法眾多，采用不同的提取方法獲得的DNA含量和純度也不同[19]。提取結果受到多重因素的影響，如樣品的采集的方法、保存的條件等等，忽視其中任何一個環(huán)節(jié)，都會給試驗結果帶來不利影響甚至導致試驗失敗，進而影響后續(xù)試驗，這是阻礙糞便DNA提取技術推廣的主要原因。故基因組DNA的成功提取及穩(wěn)定的PCR反應體系的建立成為開展該方面研究的前提。因此，針對不同的動物應選取不同的提取程序，并加以適當?shù)母倪M。選擇構建一套效果好、通用性好、性價比高的糞便樣品總DNA提取方法相當重要，可以大大推進糞便DNA診斷技術的推廣。

為了比較不同抽提方法對結腸小袋蟲DNA的提取效率和質量及對結腸小袋蟲PCR檢測的影響，本試驗采用3種商品化基因組DNA提取試劑盒和經典酚-氯仿法，分別對糞便樣品進行DNA提取，測定濃度，作為模板，進行PCR檢測，觀察不同抽提方法提取DNA的擴增效果。結果顯示，4種提取方法均能擴增出目的條帶，糞便抽提試劑盒的PCR擴增效果最好，通過此方法獲得的DNA含量達到42.05 ng/μL。王宏等[20]通過采用糞便基因組DNA提取試劑盒對獼猴的新鮮水樣糞便進行基因組DNA的提取，測得DNA質量濃度也達到40 mg/L以上。單磊等[21]也證實商品化的抽提試劑盒具有一定的優(yōu)越性。同時利用糞便抽提試劑盒對68份廣西地區(qū)采集的腹瀉糞便進行DNA提取，進行PCR檢測，結果顯示陽性率為17.65%(12/68)，與鏡檢結果相一致。