王召陽，蔣亞君，劉雪婷，侯紹華，郭曉宇，鑫 婷，朱鴻飛，賈 紅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。CDV可引起多種食肉動物感染，發(fā)病率高，致死率高達(dá)50%[2]，嚴(yán)重威脅犬只健康。犬瘟熱也對其他野生動物，包括東北虎[3]、大熊貓、獅子、獼猴[4-5]等造成嚴(yán)重威脅。臨床癥狀主要包括眼鼻分泌物增多、雙相熱、腹瀉、嘔吐、足墊增厚和抽搐等[1,6]，且CDV常與其他病原(犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒蟲和滴蟲等)共同感染[7-8]。

目前預(yù)防犬瘟熱的主要方法是疫苗免疫接種，正確的疫苗接種可提供長期的免疫保護(hù)[9]，然而仍有免疫動物發(fā)生CDV感染的情況[10]?？赡苁荂DV發(fā)生變異，導(dǎo)致疫苗免疫保護(hù)效果降低所致，因此對流行的CDV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析具有重要意義。CDV是一種帶囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科，麻疹病毒屬[9]，包含6個基因區(qū)域，分別以獨立、不重疊的轉(zhuǎn)錄單位排列的6個結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、病毒聚合酶(L)、基質(zhì)膜蛋白(M)、血凝素(H)和融合蛋白糖蛋白(F)[11]。其中，H蛋白是主要的抗原決定簇[12]，決定病毒的趨向性，在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，感染CDV恢復(fù)的犬可產(chǎn)生針對H蛋白的中和抗體，達(dá)到終生免疫[11]。有報道顯示CDV免疫小鼠后，可篩選到具有中和活性靶向H蛋白單克隆抗體[13]。并且H蛋白存在糖基化位點，而糖基化與CDV的毒力有關(guān)[14]。同時，H蛋白變異率較高，常用于分析不同CDV毒株之間的遺傳變異[9]，因此本研究選用CDV的H基因進(jìn)行克隆及分析其遺傳進(jìn)化規(guī)律。

CDV毒株的基因型分布大體上遵循地理分布的原則[15]，但由于經(jīng)濟全球化的發(fā)展、各地區(qū)文化科技的交流，病毒的遺傳進(jìn)化也有所改變，Asia-Ⅲ和Asia-Ⅳ都曾在中國報道[9]。近期CDV在靈長類身上感染的報道[5]也提示該病毒有感染人類的潛在可能性[16]，因此監(jiān)測CDV流行情況極其重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 采集2019年1月-6月濟南市某寵物醫(yī)院7份臨床樣品(眼鼻拭子)，置于-20℃保存。該樣品均來自疑似患犬瘟熱疾病的犬，并且犬瘟熱抗原膠體金檢測試紙條為陽性。

1.1.2 主要試劑 高保真酶(2×Phanta Max Master Mix)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、TA/Blunt-Zero Cloning Kit，南京諾唯贊公司產(chǎn)品；核酸染料，北京聚合美公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep kit，康寧生命科學(xué)有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，湖南艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 離心機(5430R)、PCR儀、移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀,Bio-RAD公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 2500),上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 按收集到樣品的先后順序進(jìn)行編號，依次編號為SD-01、SD-02、SD-03、SD-04、SD-05、SD-06、SD-07。將眼鼻分泌物拭子置于含有0.5 mL PBS的EP管中，置于冰上5 min,并不時攪拌使眼鼻分泌物充分溶解到PBS中，反復(fù)凍融3次。12 000 r/min離心10 min，吸取上清200 μL，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將制備好的樣品按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit說明書進(jìn)行提取。提取完成后按照Evo M-MLV RT for PCR Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的CDV H基因序列信息，利用DNAMan軟件設(shè)計引物如下，H-F:5`-ATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3`;H-R:5`-TCAAGGTTTTGAACGGTT-3`。引物由北京諾賽基因公司進(jìn)行合成。

1.2.4 H基因的擴增及克隆 首先PCR擴增CDV H基因，反應(yīng)體系按2×Phanta Max Master Mix 推薦設(shè)計，具體如下：Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL(10 mmol/L)，反轉(zhuǎn)錄cDNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳。參考TA/Blunt-Zero Cloning Kit說明書，連接至blunt-zero載體，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞。涂布于含有氨芐青霉素的瓊脂板，挑取單克隆菌落，送至北京諾賽基因公司進(jìn)行測序。

1.2.5 H基因序列分析 利用Meg Align軟件，將測序結(jié)果與NCBI上的CDV序列以及NCBI Blast分析近似序列進(jìn)行同源性分析,并利用MEGA6軟件根據(jù)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用最大似然法、Bootstrap值(1 000)進(jìn)行分析。利用NetNGlyc 1.0進(jìn)行H基因潛在糖基化位點的預(yù)測，并與典型的毒株序列進(jìn)行比對。利用Protein軟件進(jìn)行H基因抗原表位預(yù)測，并與常見疫苗株H基因抗原表位進(jìn)行對比。

2 結(jié)果

2.1 CDV H基因擴增

反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以H-F、H-R為引物進(jìn)行PCR擴增，目的片段長約1 824 bp，與預(yù)期相符(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～7.隨機采集臨床樣本SD01～SD07M.DNA Marker DL 2 000;1-7.Clinical samples SD01-SD07

2.2 CDV H基因同源性分析

利用DNA Star軟件中的Meg Align進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示,濟南市犬瘟熱H基因核苷酸、氨基酸同源性分別為98.7%～99.9%和98.7%～100%，而與疫苗株相比，核苷酸、氨基酸同源性分別為90.0%～90.9%和88.8%～91.4%(圖2和圖3)。

圖2 濟南市CDV與疫苗株核苷酸同源性分析

圖3 濟南市CDV與疫苗株氨基酸同源性分析

2.3 CDV H基因遺傳進(jìn)化樹分析

參考NCBI部分參考毒株與7株檢測毒株的H基因DNA序列，利用MEGA6軟件，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，濟南市7株毒株均屬于Asia-Ⅰ型，均為強毒株，與疫苗株America-Ⅰ型遺傳關(guān)系差異明顯，其中SD06與北京分離株親緣關(guān)系最近，SD-07與黑龍江分離株HRB-E8和HLJ-1-14親緣關(guān)系最近，SD01、SD02與廣東分離株GD1811和GD1810親緣關(guān)系最近，SD-5形成一個相對獨立的分支，介于廣東分離株GD1810、GD1811與泰國分離株CDV6-TH/2014之間，SD03、SD04相對于其余5株形成一個相對獨立的小分支，通過NCBI Blast分析也為匹配到相近的序列，可能是一個新的進(jìn)化方向(圖4)。

●表示本試驗分離毒株●CDV strains in this study

2.4 CDV H基因主要氨基酸位點突變分析

由表1可知,Asia-Ⅰ型存在8個～9個潛在天冬酰胺糖基化位點，其中野毒株SD-07與MF100809.1相同，在309位缺失了潛在天冬酰胺糖基化位點。其余6株分離株均為9個潛在天冬酰胺糖基化位點。

表1 不同基因型H基因的N-X-S/T位點分布情況

2.5 CDV H基因抗原表位預(yù)測分析

利用DNA Star protein軟件對疫苗株及野毒株進(jìn)行CDV H基因抗原表位預(yù)測[17-18]。結(jié)果表明，疫苗株Onderstepoort和CDV3與野毒株在20-30、180-200、230-250、390-410、440-460、575-595位存在明顯的抗原表位差異，其中SD01-SD07在25、230-250位預(yù)測抗原表位與疫苗株Onderstepoort和CDV3差異最為明顯，SD07在180-200、440-460位預(yù)測抗原表位與疫苗株Onderstepoort和CDV3差異最為明顯，SD05在390-410、575-595預(yù)測表位抗原與疫苗株Onderstepoort和CDV3差異最為明顯(圖5)。

圖5 CDV H基因抗原表位分析

3 討論

近年來，犬瘟熱病毒的宿主范圍逐漸擴大，嚴(yán)重威脅犬及野生動物的健康[19]。引起犬瘟熱的CDV可經(jīng)呼吸道感染、通過患病犬的分泌物進(jìn)行傳播，該病毒對熱敏感，故冬春季節(jié)多發(fā)。病毒血凝素(H)蛋白的突變，特別是與信號淋巴細(xì)胞活化分子(signaling lymphocyte activating molecules，SLAM)受體結(jié)合位點的突變是導(dǎo)致宿主范圍擴大的原因之一[20]。因此，監(jiān)測CDV H基因變異情況，具有一定的公共衛(wèi)生意義。

預(yù)防犬瘟熱行之有效的方法是接種CDV疫苗，但接種疫苗后感染仍時有報道[21]。目前市場上主要的CDV疫苗為Onderstepoort株和CDV3株[17]，我國主要流行株為Asia-Ⅰ型。本試驗通過預(yù)測比較7個野毒株與疫苗株 H基因核苷酸、氨基酸序列同源性，發(fā)現(xiàn)野毒株與疫苗株之間存在明顯差異。7個野毒株的核苷酸序列同源性高達(dá)98.7%～99.9%，而與疫苗株相比，核苷酸同源性90.0%～90.9%。氨基酸序列分析顯示，7個毒株之間的同源性為98.7%～100%，而與疫苗株的同源性為88.8%～91.4%，核苷酸序列和氨基酸序列同源性差異均較大。 H蛋白的氨基酸序列可用于系統(tǒng)進(jìn)化樹分析[22]，因此本試驗通過H基因DNA序列成功構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，7株CDV野毒株均屬于Asia-Ⅰ。其中SD-6與BJ17BC1同源關(guān)系最近，SD-07株與HRB-E8、HLJ-1-14同處一個分支，SD-01、SD-02和GD1810、GD1811同處一個小的分支，值得注意的是SD-03和SD-04形成了一個單獨的小分支，說明同一地區(qū)的CDV具有較高的遺傳多樣性，但基本遵循地理分布的原則[13]。糖基化是決定許多蛋白質(zhì)抗原性的重要因素，潛在天冬酰胺糖基化位點主要與病毒的毒力、復(fù)制和抗原性有關(guān)[23]。犬瘟熱疫苗株Onderstepoort、CDV3，分別有4個、7個潛在天冬酰胺糖基化位點，而檢測的CDV H基因存在8個～9個潛在天冬酰胺糖基化位點，這可能是造成免疫失敗的原因之一。進(jìn)一步預(yù)測分析表明，野毒株與疫苗之間預(yù)測存在的明顯差異的抗原表位，也可能是免疫失敗的原因之一,二者在20-30、180-200、230-250、390-410、440-460、575-595等多個位點存在明顯的預(yù)測抗原表位差異。

本文通過檢測濟南市CDV基因型，對CDV H基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，可監(jiān)測病毒遺傳進(jìn)化情況，從而為疫苗改進(jìn)及疾病預(yù)防提供一定的數(shù)據(jù)支持。