楊 峰，陳立強 ，許信剛，張為民*，張 琪*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.安康學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學院，陜西安康 725000)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)屬于黃病毒科瘟病毒屬，感染豬機體后會導致豬瘟，造成嚴重的經(jīng)濟損失，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為必須報告的動物傳染病之一，我國將其列為一類動物疫病[1]。CSFV感染豬不分年齡、性別和品種，四季均可發(fā)生，哺乳仔豬和保育仔豬發(fā)病率較高，成年豬長期帶毒、排毒，形成垂直和水平傳播，在豬場反復循環(huán)。我國除西藏等地外，其他地區(qū)時有CSF發(fā)生的報道，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2-3]。

自20世紀90年代以來，隨著我國對豬瘟疫苗的大面積使用，豬瘟常呈非典型的溫和臨床經(jīng)過，以及長期的隱性帶毒感染，這給臨床診斷造成了較大的困難[4]。因此，臨床上常借助反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法檢測CSFV，然而,常規(guī)的RT-PCR方法在靈敏度和重復性以及病毒含量測定等方面存在一些不足。實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)因具有操作簡單、靈敏度高、重復性好、耗時短、結(jié)果量化等優(yōu)點，逐漸在實驗室對CSFV檢測中得到了廣泛的應(yīng)用[5-8]，其中SYBR Green熒光染料法RT-qPCR比探針法費用較低，故得到較普遍的使用，但其存在染料重分布等缺點，而飽和熒光染料Eva Green解決了這一問題。本研究針對NCBI中登錄的豬瘟病毒的E2基因設(shè)計特異性引物，建立基于Eva Green熒光染料的 RT-qPCR檢測方法，以期為CSFV的臨床檢測提供一種特異、靈敏、快速及量化的方法，能夠高效、快速地的檢出早期感染和隱性帶毒者，為豬瘟防控與凈化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和菌株 豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院微生物實驗室分離保存；感受態(tài)細胞DH5α大腸埃希氏菌，購自康維世紀生物科技公司。

1.1.2 待檢組織或病料 31份病料來自陜西省不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場臨床剖檢疑似感染CSFV豬的扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟等，每頭豬的各種組織混合為1份病料。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker DL2 000和2×TaqMaster Mix，康維世紀生物科技公司產(chǎn)品；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技公司產(chǎn)品；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEAST-T1克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，全式金生物公司產(chǎn)品；2×Eva Green Premix，ABM生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 實時熒光定量PCR儀(TL988)，西安天隆生物儀器有限公司;高速冷凍離心機(D3024R)，美國貝克曼股份有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器(LS-50HJ)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(Geno Sens1800)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；電子天平(DTC)，亞津電子科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 參考NCBI中登錄的豬瘟病毒的E2基因序列(EF683623.1，F(xiàn)J598612.1，DQ907718.1等)，分析其保守序列，用Primer 5軟件設(shè)計一對引物。所設(shè)計的熒光定量特異性上、下游引物序列分別為CSFV-F：5'- TTTACCCACTTCCGTGACATT -3'，CSFV-R：5'- GACACCCGTCCACCCTATT -3'，擴增片段長度為190 bp。引物由西安擎科澤西生物公司合成并稀釋至10 μmol/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CSFV RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取保存的病毒液200 μL，加1 mL Trizol試劑，使用Trizol法提RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA置 -20℃存儲或進行普通RT-PCR。

1.2.3 RT-PCR擴增 反應(yīng)體系50 μL：2×TaqMaster Mix、模板、上游引物、下游引物分別為25 μL、6 μL、4 μL、4 μL，雙蒸水補足。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4 RT-qPCR陽性質(zhì)粒及標準模板制備 按照膠回收試劑盒回收1.2.3擴增的目的片段，并將其按照pEAST-T1克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒菌。重組質(zhì)粒菌經(jīng)常規(guī)PCR鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒菌中的陽性質(zhì)粒按照試劑盒的操作步驟提取，進行測序分析。用超微量光譜分析儀測定陽性質(zhì)粒濃度，按照以下公式將濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，然后進行10-1～10-9的梯度稀釋。稀釋后的質(zhì)粒作為標準模板，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。拷貝?shù)(copies/μL)=C×NA/MW，式中C為陽性質(zhì)粒測定的濃度，單位為ng/μL，NA取值為6.02×1023copies/mol，MW為平均分子量，單位為Dolton。

1.2.5 RT-qPCR擴增 反應(yīng)體系10 μL：2×Eva Green Premix、標準模板、上游引物、下游引物分別為5 μL、1 μL、0.3 μL、0.3 μL，ddH2O補足。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，采集熒光信號，35個循環(huán)。

1.2.6 RT-qPCR反應(yīng)標準曲線建立 選取濃度稀釋了10-2～10-8的標準模板為模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進行RT-qPCR擴增。結(jié)果以RT-qPCR儀自帶軟件分析繪制擴增曲線、標準曲線和熔解曲線。

1.2.7 RT-qPCR特異性試驗 用建立的RT-qPCR方法分別檢測PEDV、PCV2、PRV、PRRSV的cDNA或者DNA，驗證建立的RT-qPCR方法的特異性。

1.2.8 RT-qPCR靈敏性試驗 選取濃度稀釋了10-7～10-10的標準模板為陽性模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進行RT-qPCR方法。選取濃度稀釋了10-6～10-9的標準模板為陽性模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進行常規(guī)PCR擴增，將所得結(jié)果進行對比，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.9 RT-qPCR重復性試驗 以同一批次不同濃度的標準模板和不同批次不同濃度的標準模板為陽性模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進行RT-qPCR擴增，分別計算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.2.10 臨床樣本的檢測 取疑似CSFV感染的病料，加適量PBS研磨，將研磨液凍融3次后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA做待測樣本，以標準模板做陽性對照模板，以ddH2O為陰性對照模板，用所建立的RT-qPCR檢測，然后將RT-qPCR檢測為陽性的樣品進行常規(guī)RT-PCR檢測，統(tǒng)計結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)RT-PCR對豬瘟病毒E2基因的擴增

對CSFV E2基因進行常規(guī)RT-PCR擴增，結(jié)果與預期大小一致，目的片段為190 bp，而且無雜帶(圖1)，說明提取并逆轉(zhuǎn)錄得到的為CSFV的cDNA，且設(shè)計的引物可作為檢測CSFV的特異性引物，可以進行后續(xù)試驗。

M.DNA 標準DL 2 000;1.CSFV RT-PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

2.2 重組陽性質(zhì)粒常規(guī)PCR鑒定

將菌液用熒光定量特異性引物進行常規(guī)PCR檢測，結(jié)果為190 bp目的片段(圖2)。將鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，通過Blast比對，結(jié)果同源性達99%，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陽性質(zhì)粒普通PCR產(chǎn)物；2.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products of positive plasmids;2.Negative control

2.3 RT-qPCR標準模板的制備

用超微量光譜分析儀測定提取質(zhì)粒的濃度為110.5 ng/μL，OD260/OD280值為1.885，計算得拷貝數(shù)為2.447×1010copies/μL，將其稀釋至濃度分別為2.447×109、2.447×108、2.447×107、2.447×106、2.447×105、2.447×104、2.447×103、2.447×102、2.447×101、2.447×100copies/μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 RT-qPCR反應(yīng)標準曲線建立

RT-qPCR 標準模板的擴增曲線如圖3所示，相應(yīng)的標準曲線如圖4所示，其熔解曲線如圖5所示。在2.447×102copies/μL～2.447×108copies/μL的濃度區(qū)間內(nèi)，所得拷貝數(shù)(x)與Ct值(y)的線性方程為y=-3.285+36.158x，線性相關(guān)系數(shù)R2=1.000，顯示了良好的線性關(guān)系。熔解曲線峰型單一，無雜峰，熔解溫度一致， Tm=83.5 ℃。

1～7.2.447×108 copies/μL～2.447×102 copies/μL；NC.陰性對照1-7.RT-qPCR amplification curve of 2.447×108 copies/μL to 2.447×102 copies/μL；NC.Negative control

圖4 實時熒光定量PCR標準曲線

圖5 實時熒光定量PCR熔解曲線

2.5 RT-qPCR特異性試驗

分別以PEDV、PCV2、PRV和PRRSV的cDNA或者DNA為反應(yīng)模板，用建立的RT-qPCR方法擴增，結(jié)果表明只有CSFV有熒光信號(圖6)，熔解曲線峰型單一，無雜峰，熔解溫度為83.5 ℃(圖7)，說明所建立的RT-qPCR特異性好。

圖6 RT-qPCR特異性試驗擴增曲線

圖7 RT-qPCR特異性試驗熔解曲線

2.6 RT-qPCR靈敏性試驗

以2.447×103copies/μL～2.447×100copies/μL的標準模板為反應(yīng)模板，進行RT-qPCR方法擴增。以 2.447×104copies/μL～2.447×101copies/μL的標準模板作為反應(yīng)模板，進行普通PCR擴增。結(jié)果表明，RT-qPCR檢測的拷貝數(shù)最低為2.447×101copies/μL(圖8)，普通PCR檢測的拷貝數(shù)最低為2.447×103copies/μL(圖9)，說明建立的RT-qPCR檢測方法比普通RT-PCR靈敏性提高100倍。

1～4.2.447×103 copies/μL～2.447×100 copies/μL;NC.陰性對照1-4.RT-qPCR amplification curve of 2.447×103 copies/μL to 2.447×100 copies/μL;NC. Negative control

M.DNA 標準DL 2 000;1～4. 2.447×104 copies/μL～2.447×101 copies/μL；NC.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-4.2.447×104 copies/μL to 2.447×101 copies/μL;NC.Negative control

2.7 RT-qPCR重復性試驗

以2.447×106、2.447×106、2.447×104copies/μL的標準模板為反應(yīng)模板，每個模板做3個重復，進行組內(nèi)重復試驗(表1)，每隔1周做1次，每次做3個重復，計算平均值，做3次，進行組間重復試驗(表2)。結(jié)果顯示，建立的RT-qPCR的變異系數(shù)小于1.5%，其重復性表現(xiàn)優(yōu)異。

表1 RT-qPCR組內(nèi)重復試驗

表2 RT-qPCR組間重復試驗

2.8 檢測方法的初步應(yīng)用

用普通RT-PCR和建立的RT-qPCR對懷疑CSFV感染的31份臨床病料進行檢測。結(jié)果用普通RT-PCR檢出25份陽性，RT-qPCR檢測出29份陽性(包括普通RT-PCR檢出25份陽性在內(nèi))，RT-qPCR比普通RT-PCR多檢出4份。

3 討論

目前，我國豬瘟由大規(guī)模暴發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)樯l(fā)或地方流行，臨床上由典型癥狀轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫桶Y狀、隱性帶毒、持續(xù)感染。因此，通過分子生物學技術(shù)檢測手段對早期感染和隱性帶毒者高效、快速的檢出，就可以為豬瘟防控與凈化提供一定的幫助。分子生物學檢測方法主要有常規(guī)RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR及實時熒光定量RT-PCR,其中用熒光標記方法檢測特異性產(chǎn)物的RT-qPCR技術(shù)，因其靈敏度高、重復性好、定量準確、耗時短、過程封閉等眾多優(yōu)點，逐漸在病原體檢測、目的基因表達量、疫苗質(zhì)量控制等方面得到廣泛的使用[9]。

RT-qPCR有熒光染料法和Taqman探針法兩種，由于Taqman探針法相對熒光染料法比較昂貴，因此使用最多的是熒光染料法，其中SYBR熒光法使用的最普遍，然而該熒光是一種不飽和熒光，在濃度高的時候會對PCR的擴增過程產(chǎn)生一定的抑制，所以在使用時加入的量相對較小，這樣又會致使DNA的雙鏈位點不能被熒光染料充分的全部結(jié)合。但是Eva Green與此不同，它是飽和熒光染料，沒有非飽和染料“染料重排”的缺點，制作的熔解曲線分辨率相對較高，而且其可以在擴增過程當中及時地從DNA雙鏈中釋放出來，從而降低了對PCR擴增過程的影響，因此使用Eva Green染料定量，比使用SYBR染料準確性高[10]。故此，本研究選取Eva Green作為RT-qPCR的熒光染料。

因為熒光染料能夠被結(jié)合到任何脫氧核糖核酸的雙鏈間，所以RT-qPCR熒光染料法的引物在設(shè)計時要認真考慮長度、退火溫度、保守性、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等方面的問題，尤其是其中的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)問題，其關(guān)系到定量的準確性[11]。在試驗時，還要注意做好防污染工作，盡管試驗操作比較簡單，但操作中的污染如氣溶膠的污染會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；在制作標準模板時，要使陽性質(zhì)粒完全混合均勻，以此保證標準模板的濃度梯度正確性。以上方面考慮的越周全，得到的結(jié)果越穩(wěn)定，越可靠。

國內(nèi)流行的豬瘟病毒基因型以基因2群和1群為主[12]，其中CSFV E2基因的蛋白對病毒毒力影響很大[13]，因此本研究選擇CSFV E2基因的保守序列，設(shè)計了一對用于RT-qPCR擴增目的片段為190 bp的特異性引物，構(gòu)建陽性質(zhì)粒標準模板，將Eva Green作為信號報告熒光。結(jié)果表明，建立的CSFV RT-qPCR檢測方法的標準曲線線性關(guān)系良好，各梯度標準模板擴增效率一致，熔解曲線峰型單一。本研究建立的CSFV RT-qPCR檢測方法特異性強，只能檢測出CSFV，最低檢測拷貝數(shù)為2.447×101copies/μL，與普通RT-PCR相比靈敏性提高100倍；重復試驗的變異系數(shù)在1.5%之內(nèi)，重復性良好；用建立的RT-qPCR方法檢測31份懷疑CSFV感染的樣本，結(jié)果比普通RT-PCR的檢測結(jié)果多出4份陽性；整個RT-qPCR擴增過程只需45 min，時間過程短。綜上所述，本研究建立的豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和重復性，而且耗時短，可用于臨床檢測豬瘟病毒感染。