王曉艷，李偉霞，張 輝，張明亮，孟祥樂，賈文匯，牛 璐，王 炎，唐進法

(河南中醫(yī)藥大學 1.第一附屬醫(yī)院中藥臨床評價技術(shù)河南省工程實驗室，河南 鄭州 450000,2.藥學院，河南 鄭州 450046)

五味子SchisandraechinensisFructus為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實，習稱“北五味子”。因其具有酸、苦、甘、辛、咸等五味而得名，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心悸失眠[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子中活性最強的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素-五味子素B(Schisandrin B，Sch B)，一次大劑量(0.1 ～ 2 g·kg-1)給藥，在一定時間內(nèi)(12～96 h)與臨床高脂血癥-脂肪肝-肝損傷的發(fā)病過程極為接近，且此過程可被臨床常用降血脂藥-非諾貝特所逆轉(zhuǎn)[2-4]。Sch B在人體中的最佳日劑量尚未確定，藥典規(guī)定五味子用量2～6 g，但有文獻研究建議成人五味子劑量為0.5～1.5 g，每天兩次[5]，相當于Sch B每天20～60 mg[6]。臨床上所用五味子劑量較大，遠遠超出了五味子的推薦用量，相當?shù)腟ch B的含量也超出了引起小鼠高脂血癥的最低劑量的人的等效劑量(973 mg)，致使五味子存在誘發(fā)高脂血癥和脂肪肝的潛在風險。

甘草GlycyrrhizaeRadixEtRhizoma為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，味甘、性平，可緩和諸藥之偏性，還能緩急止痛，顧護肝臟之氣血，有“解毒之王”之稱。臨床上含五味子的中藥方劑，多含甘草，如桂苓五味甘草湯含甘草半升，小青龍湯中甘草三兩，養(yǎng)陰益氣湯中含甘草15 g，茵陳退黃湯中甘草3 g，各方中五味子-甘草配比用量不同。上述方劑臨床應用并未發(fā)現(xiàn)脂代謝紊亂、誘發(fā)高脂血癥和脂肪肝現(xiàn)象，或與甘草的“解毒”作用密切相關(guān)。

血液中甘油三酯(triglyceride，TG)主要有內(nèi)源性和外源性兩個途徑，外源性途徑是指食物中的脂肪在小腸分解為脂肪酸、甘油二酯和甘油一酯，當這些產(chǎn)物吸收入小腸細胞后合成TG，并和膽固醇一起形成乳糜微粒，通過淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)[7]。而內(nèi)源性途徑則是在肝臟中進行，肝臟會將糖類轉(zhuǎn)化成脂肪酸或從頭合成脂肪酸，脂肪酸繼而與甘油酯化形成TG，最后與載脂蛋白B等脂蛋白裝配形成極低密度脂蛋白，并分泌入血[8]。而固醇調(diào)控原件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activiated receptor-α，PPARα)是TG合成途徑中重要的調(diào)控因子，通過對其下游靶基因的調(diào)節(jié)，進而影響脂肪酸和TG的合成。

基于此，本實驗擬以五味子和甘草為研究對象，觀察大劑量五味子對正常小鼠血脂的影響，同時觀察配伍甘草后的血脂變化，以期為五味子臨床合理應用提供數(shù)據(jù)支撐。并針對TG的合成途徑進一步探討其調(diào)脂的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器Neofuge 1600R型低溫臺式高速離心機(上海力申科學儀器有限公司)；Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾科技公司)；ECLIPSE 80i型顯微鏡(日本尼康)；Rm-2235型石蠟切片機(德國萊卡公司)；TL-820型冰凍切片機(湖北泰維科技實業(yè)有限公司)；EG1150H型包埋機(德國萊卡公司)。

1.2 試劑TG(批號20190615)、總膽固醇(total cholesterol，TC，批號20190615)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C，批號20190316)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C，批號20190318)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT，批號20190320)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS，批號0911E19)、乙酰輔酶A羧化酶(acctyl-COA carboxylase，ACC，批號0911E19)、乙?；o酶A氧化酶(acy-CoA oxidase，ACO，批號0911E19)、甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶(Glycerol triphosphate acyltransferase，GPAT，批號0911E19)ELISA試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司；SREBP-1c(貨號ab28481)抗體購自abcam公司；PPARα(貨號GB11163)購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 藥物與其制備五味子(批號19060102，鄭州瑞龍制藥股份有限公司)；甘草(批號19080101，鄭州瑞龍制藥股份有限公司)；稱取五味子及五味子-甘草不同配比(1 ∶1、1 ∶1.5)混合藥材適量，粉碎，用5倍量80%乙醇浸泡0.5 h后，回流提取兩次，第一次回流1.5 h，第二次回流2 h。提取物過濾得濾液，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回旋至無醇味后濃縮，得五味子醇提物及五味子-甘草不同配比浸膏。其中，五味子組浸膏生藥含量為1.43 g·g-1，五味子-甘草(1 ∶1)和五味子-甘草(1 ∶1.5)浸膏中五味子生藥含量分別為0.465和0.428 g·g-1。

1.4 動物分組與給藥ICR小鼠，♂，體質(zhì)量(22.47±0.68)g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK(京)2016-0006。本實驗通過河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(批準號YFYDW2019006)。ICR小鼠分為4組，分別為:正常對照組(Control)、五味子組(SchisandraechinensisFructus，SF)和五味子-甘草配伍2個配比組(SchisandraechinensisFructus-GlycyrrhizaeRadixEtRhizoma，SG，1 ∶1，1 ∶1.5)，每組10只。五味子-甘草配伍比例依據(jù)桂苓五味甘草湯(1 ∶1)及養(yǎng)陰益氣湯(約1 ∶1.5)。給藥組均按照五味子藥典規(guī)定臨床等效劑量的5倍量(3.9 g·kg-1)進行灌胃給藥。對照組小鼠灌胃給予等體積的生理鹽水，每日灌胃給藥1次，連續(xù)10 d共給藥10次。

1.5 生化法檢測血脂變化末次給藥8 h后，小鼠經(jīng)眼眶取血，置于EP管中，室溫靜置2 h后，3 500 r·min-1離心10 min(4 ℃)，取血清，-80 ℃分裝凍存。嚴格按照試劑盒說明書，檢測小鼠血清TG、TC、HDL、LDL含量。

1.6 生化法檢測肝功能變化取出分裝凍存的血清至室溫，嚴格按照試劑盒說明書，利用酶標儀檢測血清中ALT活性。

1.7 肝臟病理學檢查取血后立即取出肝臟，取同一部位的肝臟組織塊約0.5 cm3，迅速投入10%的中性福爾馬林中充分固定。固定48 h以上的小鼠肝臟組織，制備常規(guī)肝臟病理學切片，HE染色后，觀察其病理學變化。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附法檢測肝臟FAS、ACC酶活性和GPAT、ACO水平各組肝臟組織，用生理鹽水經(jīng)組織勻漿機研磨成組織勻漿，4 ℃，4 000 r·min-1離心15 min后，取上清液，采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書，利用酶標儀對肝臟FAS、ACC活性和GPAT、ACO水平進行檢測。

1.9 免疫組化法檢測肝臟受體SREBP-1c、PPARα蛋白表達采用免疫組化法檢測肝臟組織中SREBP-1c、PPARα蛋白的表達。切片脫蠟至水，PBS沖洗3×5 min。檸檬酸抗原修復5～10 min，自然冷卻。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)。3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫20 min。PBS浸泡5 min，3次。滴加一抗(1 ∶100)50 μL/片，4 ℃過夜。PBS浸泡5 min，3次。滴加HRP標記二抗50 μL/片，37 ℃孵育30 min，PBS浸泡5 min，3次。DAB顯色，顯微鏡下控制，自來水中止。蘇木精復染，梯度酒精(80%-95%Ⅰ-95%Ⅱ-100%Ⅰ-100%Ⅱ)脫水，二甲苯(I和II)透明，中性樹膠進行封片，置于光學顯微鏡下進行觀察并拍照，Image Pro Plus 6.0 軟件分析平均吸光度值。

1.10 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 血脂變化與Control相比，SF組小鼠血清TG和TC水平明顯升高(P<0.05)，血清HDL水平明顯降低(P<0.05)。與SF相比，SG 1 ∶1可明顯降低血清TG水平(P<0.05)。見Tab 1。

2.2 肝功能變化與Control組比，SF組小鼠血清ALT活性明顯升高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與SF組相比，SG 1 ∶1.5可明顯降低血清ALT活性(P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Activity of serum n=10)

2.3 肝臟組織病理學變化在光鏡下，對照組可見細胞形態(tài)規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細胞質(zhì)均勻，肝細胞自中央靜脈為中心，呈放射狀排列，伸向肝小葉周邊部，肝血竇竇間隙清晰；五味子組肝小葉輪廓不清晰，中央靜脈周圍肝細胞條索少見，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)較多的脂肪空泡，散布在整個胞質(zhì)中，小葉內(nèi)有少量炎性細胞浸潤；五味子-甘草 1 ∶1組部分肝細胞結(jié)構(gòu)異常，中央靜脈周圍肝細胞索少見，部分細胞內(nèi)可見較大的脂肪空泡；五味子-甘草 1 ∶1.5組肝細胞條索依稀可見，有部分細胞內(nèi)存在少量的脂肪空泡。見Fig 2A-D。

2.4 肝臟組織FAS、ACC活性和GPAT、ACO水平變化與Control組比，SF組小鼠ACC活性和GPAT水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；SG 1 ∶1和SG 1 ∶1.5組小鼠GPAT水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；SG 1 ∶1和SG 1 ∶1.5組小鼠ACO水平明顯降低(P<0.01)。與SF相比，SG 1 ∶1組GPAT和ACO水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見Tab 2。

Fig 2 Histopathological changes of liver (×200)(n=4)

2.5 肝臟組織SREBP-1c、PPARα蛋白表達變化SREBP-1c蛋白陽性表達為棕褐色。SF小鼠SREBP-1c顏色較深，圖像分析結(jié)果表明，蛋白表達量較對照組明顯上調(diào)(P<0.01)。SG 1 ∶1和1 ∶1.5組棕褐色較五味子組淺，圖像分析結(jié)果表明，SREBP-1c蛋白表達量較SF組明顯下調(diào)(P<0.05，P<0.01)。見Fig 3。

PPARα蛋白陽性表達為棕褐色。結(jié)果可見，Control組小鼠PPARα蛋白表達量較多，SF組小鼠較對照組陽性表達減少，圖像分析結(jié)果表明，PPARα蛋白表達明顯降低(P<0.01)，SG 1 ∶1和1 ∶1.5組陽性染色較五味子組增多，圖像分析結(jié)果表明PPARα蛋白表達較SF組明顯增多(P<0.05，P<0.01)。見Fig 4。

3 討論

現(xiàn)代研究表明五味子在中樞系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟和生殖系統(tǒng)等方面應用廣泛，具有保護肝臟、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血脂和抗炎等作用[9]，并有研究表明五味子具有“適應原”樣作用[10]，在中樞系統(tǒng)具有“雙向調(diào)節(jié)”作用。而作為五味子中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，Sch B(50～200 mg·kg-1)小劑量可降低高膽固醇血癥小鼠肝臟TC和TG的含量，一次大劑量給藥能時間和劑量依賴性的升高小鼠血TG含量，并伴隨肝TG含量升高[2-3]，存在“雙向調(diào)節(jié)”作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，低劑量五味子醇提物可降低高膽固醇血癥小鼠血清和肝臟TG含量[11]，本實驗發(fā)現(xiàn)高劑量的五味子可升高正常小鼠血TG和TC含量，說明五味子在調(diào)節(jié)血脂方面存在“雙向調(diào)節(jié)”作用。

Tab 1 Influence of Schisandrae Fructus and compatible with Glycyrrhiza on levels of serum TG, TC, HDL and LDL in normal n=10)

Tab 2 Influence of Schisandrae Fructus and compatible with Glycyrrhiza on activities of liver ACC and FAS and GPAT, ACO levels in normal n=10)

Fig 3 Expression of liver tissue SREBP-1c protein detected by

中藥劑量是指臨床應用時的分量，它主要指明了每味藥的成人一日量。其次指方劑中每味藥之間的比較分量，也即相對劑量。準確地掌握用藥劑量是確保用藥安全、有效的重要因素之一。由于諸多原因，中藥飲片超劑量應用現(xiàn)象越來越普遍，由此直接導致了我國中藥資源的大量浪費，并且有研究報道超劑量使用與不良反應的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)性，進而導致中藥飲片的不良反應發(fā)生率日益增多。中藥的配伍應用是中醫(yī)用藥的主要形式，其作用是綜合性的表現(xiàn)，并非指所有組成藥物的功效和劑量的簡單組合，通過配伍可提高藥效、降低毒副作用、適應復雜病情、擴大治療范圍并預防藥物性中毒。本實驗結(jié)果顯示，與五味子組比，五味子-甘草1 ∶1組血清TG含量明顯降低，表明甘草與五味子配伍可明顯降低大劑量五味子誘發(fā)高甘油三酯血癥的風險。

Fig 4 Expression of liver tissue PPARα protein detected

HDL和LDL是體內(nèi)運載磷脂和膽固醇最重要的蛋白。HDL具有逆向運輸膽固醇功能，即將肝外組織中過多的膽固醇從外周組織轉(zhuǎn)運到肝臟進行代謝，通過膽汁酸或者直接通過膽汁從腸道排出，以防膽固醇在這些組織中過多地聚集，因此被認為是好的脂蛋白[12]。LDL由VLDL轉(zhuǎn)變而來，能將肝臟中的TC轉(zhuǎn)移到外周組織(如血管壁)，易造成動脈粥樣硬化，從而增加了冠心病的危險性，通常被稱為壞的脂蛋白[13]。本實驗結(jié)果顯示，大劑量五味子可明顯降低血清HDL水平，可能為其升高血清TC含量的機制之一。

SREBP-1c和PPARα在TG合成途徑中發(fā)揮重要作用[14]。肝臟中SREBP-1c作為負責調(diào)解脂肪酸和甘油三酯的重要調(diào)控蛋白，主要通過調(diào)節(jié)其下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的靶基因，包括ACC、FAS、GPAT等的表達來調(diào)節(jié)肝臟中TG的合成。ACC作為脂肪酸合成的限速酶，與脂肪合成速率密切相關(guān)；而FAS是內(nèi)源性脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，在機體脂質(zhì)沉積過程中發(fā)揮重要作用[15]。GPAT是TG合成的關(guān)鍵限速酶之一，研究報道[16]，敲除GPAT基因可以減少小鼠肝臟TG沉積并改善肝臟胰島素抵抗。本實驗結(jié)果顯示，五味子組小鼠表現(xiàn)為肝臟SREBP-1c蛋白表達量、ACC活性和GPAT水平明顯升高，說明五味子增加肝臟中TG合成的機制可能是通過增強肝臟SREBP-1c蛋白的表達，并上調(diào)肝臟ACC活性及GPAT含量。與五味子比，五味子-甘草 1 ∶1組GPAT水平明顯降低，說明甘草配伍五味子降低五味子升高的TG含量可能與調(diào)節(jié)GPAT有關(guān)。

PPARα作為一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核轉(zhuǎn)錄因子，主要通過影響脂蛋白及長鏈脂肪酸的代謝，進而調(diào)控脂質(zhì)代謝，研究表明，PPARα激活后，可直接增加脂肪酸的氧化，減少脂肪的積聚，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[17]，同時可上調(diào)其下游基因ACO的表達，從而降低TG的合成水平。ACO作為脂肪酸β-氧化反應的關(guān)鍵酶之一，可催化肝臟細胞內(nèi)脂滴的氧化分解過程[18]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子組小鼠肝臟PPARα蛋白表達量明顯降低，ACO水平有降低趨勢，五味子-甘草 1 ∶1和1 ∶1.5組PPARα蛋白表達量較五味子組明顯升高，表明甘草通過上調(diào)PPARα蛋白的表達，從而加速脂肪酸的β氧化分解，最終可減少高劑量五味子誘發(fā)的TG合成增加。

綜上表明，高劑量的五味子一方面增加TG的合成速度，其機制可能是增加肝臟中SREBP-1c的蛋白表達，上調(diào)脂肪酸合成過程的限速酶ACC活性和TG合成過程中關(guān)鍵酶GPAT含量；另一方面，降低脂肪酸的β氧化，增加TG在肝臟中的沉積，其機制可能為下調(diào)肝臟PPARα蛋白的表達，降低脂肪酸β-氧化途徑的關(guān)鍵酶ACO的活性。通過以上兩種途徑聯(lián)合增加肝臟中TG的合成，誘發(fā)高脂血癥，而甘草配伍五味子后可通過調(diào)節(jié)TG合成途徑相關(guān)蛋白，降低五味子誘發(fā)的高脂血癥風險。由此說明，臨床應用五味子時需對其用藥劑量慎重考慮，建議配伍同等劑量的甘草，避免其在血脂方面的“雙向調(diào)節(jié)”作用，為五味子的臨床合理應用提供數(shù)據(jù)支撐。

(致謝:本實驗在河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥臨床評價技術(shù)河南省工程實驗室、中藥藥代動力學實驗室開展，感謝各位老師和同學的幫助。)