李 成，樓迪棟，齊曉嵐，范海瓊，朱 衛(wèi)，潘際剛

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

砷是一種廣泛分布于環(huán)境中的環(huán)境毒物。砷常通過水、食物、空氣等途徑進(jìn)入人體后引起人的器官或組織損傷[1]。研究表明，砷具有神經(jīng)毒性作用，其可以通過血腦屏障直接造成人大腦皮質(zhì)組織不可逆性損傷，從而引起人認(rèn)知功能障礙，并造成學(xué)習(xí)、記憶能力的減弱[2-3]。因此，開展對(duì)于砷的神經(jīng)毒性損傷及其作用機(jī)制的研究對(duì)于防治砷中毒具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本課題組前期研究表明，亞砷酸鈉對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用，而外源性過表達(dá)MPST蛋白可以拮抗砷所致的神經(jīng)毒性損傷[4]。而本研究以慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)外源MPST的SH-SY5Y細(xì)胞為觀察對(duì)象，檢測(cè)砷暴露前后GRP78和CHOP蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路是否參與砷神經(jīng)損傷以及MPST過表達(dá)對(duì)砷誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，購自德國DSMZ公司穩(wěn)定感染慢病毒載體的人的SH-SY5Y細(xì)胞(SH-PEB細(xì)胞)穩(wěn)定感染MPST重組慢病毒載體的SH-SY5Y細(xì)胞(SH-MPST細(xì)胞)

1.1.2試劑 胎牛血清(Gibco)，購自以色列BioInd公司(批號(hào):10099141C)；青霉素-鏈霉素，購自美國Gibco公司(批號(hào):15140163)；胰蛋白酶，購自美國Gibco公司(批號(hào):25200056)；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購自北京索萊寶公司(批號(hào):P1032)；DMEM培養(yǎng)基，購自美國Hyclone公司(批號(hào):SH30081)；NaAsO2，購自美國Sigma公司(批號(hào):S7400)；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78蛋白(glucose regulated p rotein，GRP78)抗體(批號(hào):sc-166490)、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)抗體(批號(hào):sc-365318)、抗小鼠IgG-HRP二抗(批號(hào):P1032)，購自美國Santa Cruz公司，?；切苋パ跄懰?TUDCA)，購自購自美國Sigma公司(批號(hào):sc-2005)。

1.1.3儀器 Model 310細(xì)胞恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(蘇州凈化)；全波段多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司)；Eclipse Ti-s倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；全自動(dòng)凝膠成像儀(美國SynGene)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞生長至70%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代或凍存。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染MPST過表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為前期已建立過表達(dá)細(xì)胞株[5]。通過PCR擴(kuò)增出MPST目的基因，并將其克隆到慢病毒表達(dá)載體pEB-GFP(T2A)PURO上，然后將重組慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)(pLP/VSVG, pLP1, pLP2)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，收集病毒液。當(dāng)SH-SY5Y細(xì)胞在12孔板生長至50%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞更換為含10 mg·L-1基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑聚凝胺(polybrene)及10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別于不同孔加入1 mL含MPST和空載體的病毒液，分別設(shè)為過表達(dá)組和空載對(duì)照組，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，更換含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%匯合度以嘌呤霉素進(jìn)行篩選，最終以蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MPST表達(dá)水平。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分6組:MPST慢病毒轉(zhuǎn)染組(SH-MPST過表達(dá)組)，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組(SH-PEB組)，染砷組(NaAsO2組)，TUDCA阻斷劑組，TUDCA預(yù)處理染砷組。

1.2.4蛋白印跡檢測(cè) 藥物處理細(xì)胞后，以RIPA細(xì)胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)裂解細(xì)胞，冰上裂解10 min，20 627×g離心15 min，取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量，計(jì)算并配制上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，用GRP78、CHOP抗體(1 ∶1 000)或內(nèi)參抗體GAPDH(1 ∶ 2 000)于4 ℃搖床孵育過夜，PBS洗膜3次，抗小鼠IgG-HRP二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，凝膠成像儀成像，以Quantity One對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果

2.1MPST過表達(dá)對(duì)細(xì)胞GRP78與CHOP蛋白表達(dá)的影響如Fig 1所示，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未染砷處理的對(duì)照組和過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)GRP78與CHOP蛋白表達(dá)無差異。

2.2 NaAsO2和TUDCA對(duì)SH-PEB細(xì)胞GRP78與CHOP蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未染砷處理的對(duì)照組細(xì)胞相比，50 μmol·L-1NaAsO2處理的對(duì)照組細(xì)胞中GRP78與CHOP蛋白明顯上調(diào)(P<0.01)；而預(yù)先加入1 mmol·L-1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑TUDCA預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)砷誘導(dǎo)的GRP78與CHOP的上調(diào)現(xiàn)象(P<0.01)。

Fig 1 Effect of MPST overexpression on expression of GRP78 (A) and CHOP (B) proteins n=3)

Fig 2 Effect of NaAsO2 and TUDCA on expressions of GRP78 (A) and CHOP (B) proteins in SH-PEB cells

2.3 NaAsO2和TUDCA對(duì)SH-MPST細(xì)胞GRP78與CHOP蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未染砷處理的過表達(dá)組細(xì)胞相比，50 μmol·L-1NaAsO2處理的過表達(dá)組細(xì)胞中GRP78與CHOP蛋白明顯下調(diào)(P<0.01)；而預(yù)先加入1 mmol·L-1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑TUDCA預(yù)處理使50 μmol·L-1NaAsO2處理的過表達(dá)組細(xì)胞中GRP78與CHOP蛋白上調(diào)(P<0.01)。

Fig 3 Effect of NaAsO2 and TUDCA on expressions of GRP78 (A) and CHOP (B) proteins in SH-MPST

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種重要的細(xì)胞器，參與并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、折疊、修飾及運(yùn)輸?shù)壬顒?dòng)。當(dāng)細(xì)胞受到遺傳因素或者環(huán)境因素影響時(shí)，會(huì)使錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、代謝綜合癥和癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。Sun等[7]通過建立大鼠飲用水染砷模型研究發(fā)現(xiàn)，慢性砷暴露處理后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降且伴隨著大鼠海馬細(xì)胞中GRP78 蛋白、PERK蛋白、ATF4蛋白、CHOP蛋白表達(dá)上調(diào)。在本實(shí)驗(yàn)中，砷暴露處理后的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的GRP78與CHOP蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，而給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑TUDCA預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)砷誘導(dǎo)的GRP78與CHOP蛋白上調(diào)現(xiàn)象。眾所皆知，GRP78與CHOP蛋白表達(dá)的變化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志[8]。這些結(jié)果共同提示砷的神經(jīng)毒性作用可能與砷誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

近年來，H2S作為一種新型氣體信號(hào)分子得到廣泛關(guān)注[9]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，H2S由胱硫醚-γ-裂合酶、胱硫醚-β-合酶和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(MPST)合成。H2S具有舒張血管、降血壓、抗凋亡、抗炎、參與抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)功能[10]。此外，Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射30或100 μmol·kg-1NaHS的生理鹽水可以改善由鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的心肌肥大，使用含NaHS的生理鹽水干預(yù)的大鼠心肌細(xì)胞中GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)降低，這說明H2S通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮心臟保護(hù)作用。本課題組前期研究表明，亞砷酸鈉對(duì) PC12 細(xì)胞的損傷作用與砷下調(diào)3MST蛋白的表達(dá)有關(guān)，外源性過表達(dá)MPST可以拮抗亞砷酸鈉的毒性損傷作用[4,12]。而本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MPST可以逆轉(zhuǎn)砷誘導(dǎo)的GRP78與CHOP蛋白上調(diào)，而且使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平明顯低于正常，這一結(jié)果提示外源性過表達(dá)MPST可以降低機(jī)體對(duì)砷刺激后一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。進(jìn)一步使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑TUDCA進(jìn)行預(yù)處理，MPST過表達(dá)對(duì)砷暴露下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激超低水平的維持效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。綜上所述，GRP78/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路參與了砷誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷；MPST過表達(dá)可降低砷誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。然而砷是如何引起GRP78、CHOP蛋白表達(dá)的變化從而發(fā)揮損傷效應(yīng)，過表達(dá)MPST又是如何在砷暴露下維持超低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，這些機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。