周慧慧，呂年銀，佟書娟，史麗云，張偉偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)病原與免疫學(xué)教研室，江蘇 南京 210023)

血吸蟲病迄今仍然在全球廣泛流行并且嚴(yán)重危害人類健康和生活。已經(jīng)明確血吸蟲感染最嚴(yán)重的病理變化是蟲卵沉積肝臟形成的蟲卵肉芽腫并繼發(fā)纖維化[1]。研究已經(jīng)證明，巨噬細(xì)胞在血吸蟲病肝臟病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，巨噬細(xì)胞感染早期向經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage，M1)轉(zhuǎn)化，高表達(dá)iNOS、CD16/32，分泌促炎因子IL-12、TNF-α，促進(jìn)Th1應(yīng)答，從而抑制肝臟肉芽腫的形成發(fā)展；蟲卵抗原SEA誘導(dǎo)替代激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage，M2)產(chǎn)生，通過高表達(dá)精氨酸酶-1(Arg1)、CD206，分泌抑炎因子IL-10、TGF-β，促進(jìn)Th2應(yīng)答從而成為促進(jìn)肝臟炎性肉芽腫及纖維化的關(guān)鍵因素[2-4]。因此，調(diào)控血吸蟲肝臟病理進(jìn)程中巨噬細(xì)胞從M1-M2表型的平衡可以成為開發(fā)治療血吸蟲病藥物的新策略。

白藜蘆醇(resveratrol)是一種非黃酮多酚類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有多種生物活性如抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等，近期有課題組發(fā)現(xiàn)其也對多種免疫細(xì)胞具有調(diào)控作用。比如，白藜蘆醇對肝臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)是通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮作用的[5]。白藜蘆醇促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化并緩解小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以調(diào)控Th1/Th2應(yīng)答抑制血吸蟲病的肝臟纖維化，提示白藜蘆醇可能在血吸蟲感染中通過調(diào)控巨噬細(xì)胞M1/M2極化進(jìn)而影響Th1/Th2應(yīng)答發(fā)揮抑制肝臟病理的作用，但還未有研究[6]。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞極化與細(xì)胞代謝存在著密切聯(lián)系，而其中線粒體發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[7-9]，如研究發(fā)現(xiàn)抑制小鼠巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶可以阻礙 LPS+IFN-γ誘導(dǎo)的線粒體呼吸功能下降，改善代謝，促進(jìn)巨噬細(xì)胞從表型M1往M2型極化。在M2型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的代謝特征表現(xiàn)為線粒體通過氧化磷酸化(OXPHOS)合成ATP為M2極化供能，且過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α (PGC-1α)高表達(dá)，能夠促進(jìn)線粒體生物合成，增強(qiáng)OXPHOS 過程產(chǎn)生更多的ATP[10]?；谏鲜龅难芯勘尘?，本研究擬采用白藜蘆醇灌胃日本血吸蟲感染小鼠，探討白藜蘆醇對M1/M2極化的影響及相應(yīng)代謝學(xué)機(jī)制，為白藜蘆醇治療血吸蟲病提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與陽性釘螺采用于南京大學(xué)模式動物研究所的清潔級6-9周齡的雌性C57BL/6小鼠60只(溫度：20 ℃；濕度：40%；籠內(nèi)密度：4；自由獲得水和食物),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)考察委員會批準(zhǔn)，按照NIH《實驗動物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行動物實驗。日本血吸蟲感染性釘螺購自南京市疾病預(yù)防控制中心。

1.2 試劑白藜蘆醇(純度為98%以上，批號KA080CA14)購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。吡喹酮購自南京制藥廠有限公司(批號20091202)。流式抗體大鼠抗小鼠F4/80-FITC(批號4281123)、大鼠抗小鼠CD16/32-PE(批號4312298)、大鼠抗小鼠CD206-PE(批號2005202)、大鼠抗小鼠CD11b-APC(批號1947198)，均購自eBioscience公司。ATP Assay Kit(批號040219190918)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。線粒體DNA檢測試劑盒(批號157052014)，購自Abcam公司。小鼠TNF-α(批號1901-2)、IL-12p40(批號E2060-1810-1)、IL-10(批號E2100-1710-1)、TGF-β ELISA(批號E2710-1910-1)檢測試劑盒，購自達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司。小鼠Arg1的ELISA檢測試劑盒，購自武漢菲恩生物技術(shù)有限公司。小鼠iNOS、Arg1、TNF-α、IL-12p40、IL-10、TGF-β和 PGC-1 α的引物，購自上海英駿生物技術(shù)有限公司。小鼠iNOS檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所(批號055541)。TRIzolTM，購自上海英駿生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Fermantas公司(批號00791016)，SYBR Green PCR Master Mix，購自Roche公司，seahorse 檢測用抑制劑，購自Agilent Technology公司。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma 公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD 公司)；超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)；低溫離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)；7500型實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；酶標(biāo)分析儀(美國Bio-Tek公司)；seahorse XFe96 分析儀(美國 Agilent Technology)。

1.4 感染模型的建立和分組取6～9周齡雌性C57BL/6小鼠45只，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(12±2)條。自感染3周后，血吸蟲感染小鼠隨機(jī)分為3組，每組15只。小鼠設(shè)4組：感染組小鼠為A組，白藜蘆醇灌胃治療的小鼠為B組，從感染第6周連續(xù)3周灌胃白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1，灌胃吡喹酮治療的小鼠為C組，從感染后第3、6周分別灌胃吡喹酮500 mg··kg-1·d-1×3 d, 另取正常健康小鼠15只為D組，為健康對照組，白藜蘆醇和吡喹酮的劑量參照已發(fā)表文獻(xiàn)[6]。

1.5 體外SEA刺激和分組取對數(shù)生長期的RAW264.7，用完全DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度都調(diào)至5×105·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板；加入PBS為PBS處理組，加入終濃度20 mg·L-1的SEA為SEA處理組，加入終濃度20 mg·L-1的SEA和終濃度為20 mg·L-1的白藜蘆醇為白藜蘆醇處理組，加入終濃度20 mg·L-1的SEA和終濃度為100 mg·L-1的吡喹酮為吡喹酮處理組，共培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。

1.6 肝臟巨噬細(xì)胞的提取摘取感染9周小鼠的肝臟，用PBS緩沖液洗2遍，剪碎，放入研磨儀中研磨5 min，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，2 000 r·min-1，4 ℃，離心，10 min，棄去上清，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液,冰上靜置后離心，取上清，再重復(fù)離心2次，均取上清。將上清2 000 r·min-1，4 ℃離心，10 min，棄掉上清，用3 mL 40% percoll 重懸細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞懸液緩慢地鋪陳到3 mL 80%的percoll上，以2 000 r·min-1，4 ℃，梯度離心20 min，取中間相液體。2 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，去上清。用10 mL完全DMEM重懸細(xì)胞沉淀，放入10 cm的培養(yǎng)皿中貼壁2 h，洗去不貼壁的細(xì)胞，得到的貼壁細(xì)胞即為肝臟巨噬細(xì)胞。

1.7 ATP assay kit檢測巨噬細(xì)胞ATP含量取2×106巨噬細(xì)胞加入200 μL細(xì)胞裂解液，用移液器反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，冰上放置30 min，4 ℃，12 000×g，5 min離心，取上清。冰上溶解待用試劑，按照說明書濃度要求配制標(biāo)準(zhǔn)品。以每孔100 μL ATP工作液加入檢測孔內(nèi)，室溫放置5 min，以消耗掉本底ATP，降低背景。在檢測孔內(nèi)加入20 μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，2 s后用酶標(biāo)儀檢測RLU值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測M1和M2巨噬細(xì)胞比例在感染第9周，脫頸處死各組小鼠，摘取肝臟剪碎，采用研磨儀制備成單細(xì)胞懸液，用完全DMEM培養(yǎng)液將濃度調(diào)節(jié)至1×109·L-1。取1mL細(xì)胞懸液，1 500 r·min-1，4℃，離心5 min，加入100 μL的PBS緩沖液，同時加入抗體CD11b-APC(0.4 g·L-1)和F4/80-FITC(0.5 g·L-1)，對于檢測M1加入CD16/32-PE(0.1 g·L-1)，對于檢測M2加入CD206(0.2 g·L-1)，混勻，置4 ℃避光孵育30 min。用PBS緩沖液洗2遍后， 加入500 μL的PBS緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson公司)檢測。

1.9 實時定量RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞中的iNOS、Arg1、TNF-α、IL-12p40、IL-10、TGF-β和PGC-1α的mRNA水平取各組小鼠2×106肝臟巨噬細(xì)胞，用TRIzolTM提取總RNA，按M-MLV轉(zhuǎn)錄cDNA。iNOS、Arg1、TNF-α、IL-12p40、IL-10、TGF-β、PGC-1 α的反應(yīng)體系都為SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 3 μL，總體積20 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，40個循環(huán)：60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，溶解曲線60-90 ℃保證擴(kuò)增為單一產(chǎn)物。以Ct值進(jìn)行結(jié)果分析，采用相對量法與內(nèi)參β-actin做比較。計算公式為：2-ΔCT,ΔCt=Ct gene-Ct control。各分子引物如下：

iNOS:F：5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGCG-3′

R: 5′-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3′

Arg1: F: 5′-TGAACACGGCAGTGGCTTTA-3′

R: 5′-GCATTCACAGTCACTTAGGTGGTTTA-3′

TNF-α: F: 5′-AAGGCCGGGGTGTCCTGGAG-3′

R: 5′-AGGCCAGGTGGGGACAGCTC-3′

IL-12:F: 5′-TGGAGCACTCCCCATTCCTA-3′

R: 5′-AGGAACGCACCTTTCTGGTT-3′

IL-10:F: 5′-CTTACTGACTGGCATGAGGATCA-3′

R: 5′-GCAGCTCTAGGAGCATGTGG-3′

TGF-β:F: 5′-CCTACCAGAACGCAGAGATCACT-3′

R: 5′-CACTCGTATCAACAGATGCGTACAT-3′

PGC-1 α：F: 5′-GCAGCCAAGACTCTGTATGG-3′

R: 5′-TTCCGATTGGTCGCTACACC-3′

1.10 ELISA檢測RAW264.7培養(yǎng)上清中iNOS、Arg1、TNF-α、IL-12p40、IL-10、TGF-β的表達(dá)水平將體外經(jīng)SEA刺激的不同處理組細(xì)胞和培養(yǎng)上清收集于15 mL離心管中，1 500 r·min-1，4 ℃離心5 min，吸取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測上述細(xì)胞因子的水平，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.11 seahorse檢測細(xì)胞耗氧量將收集的不同組的巨噬細(xì)細(xì)胞以0.2×104/孔接種于96孔seahorse檢測專用細(xì)胞培養(yǎng)板，每行培養(yǎng)板留一個孔，僅含有培養(yǎng)基，不含細(xì)胞，作為陰性對照。將含有校準(zhǔn)溶液(200 μL/孔)的測試板以及含有注射器端口和探針的板放置在37 ℃的無二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜。d 2去掉細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用 seahorse分析緩沖液(200 μL/孔)替換，并置于無二氧化碳培養(yǎng)箱中至少0.5 h。然后將抑制劑(寡霉素、FCCP、抗霉素A和魚藤酮)添加到噴油器板。該板和測試板一起在seahorse XFe96分析儀上運(yùn)行以進(jìn)行校準(zhǔn)。完成后，將測試板替換為檢測專用細(xì)胞培養(yǎng)板，并在seahorse XFe96細(xì)胞能量代謝分析儀上運(yùn)行。

1.12 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并用GraphPad Prism 6.0軟件制作統(tǒng)計圖。多組間比較宜于用方差分析，兩兩比較用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組小鼠肝臟中M1和M2的比例在日本血吸蟲感染第9周，檢測小鼠肝臟巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+)中M1(CD16/32+)和M2(CD206+)的比例發(fā)現(xiàn)，如Fig 1所示，比較健康對照組小鼠，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組的M1比例都明顯增高(P<0.05)，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組的M2比例也顯著增高(P<0.01)。但是比較感染組，白藜蘆醇治療組的M1比例顯著增高(P<0.01)，M2比例明顯降低(P<0.05)，而吡喹酮治療組的M1比例都顯著低于感染組(P<0.05)，M2比例沒有差異(P>0.05)。白藜蘆醇治療組的M1比例高于吡喹酮治療組(P<0.01)，而M2比例明顯低于吡喹酮治療組(P<0.05)。

2.2 不同處理組肝臟巨噬細(xì)胞中iNOS、Arg1、TN-α、IL-12p40、IL-10、TGF-β的mRNA水平進(jìn)一步確證白藜蘆醇對巨噬細(xì)胞極化的影響，檢測了血吸蟲感染9周各組M1和M2相關(guān)因子的表達(dá)水平。如Fig 2所示，與健康對照組比較，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠的肝臟中iNOS、Arg1、TNF-α、 IL-12p40、IL-10、TGF-β的mRNA表達(dá)水平都增高(P<0.05)，并且感染組和吡喹酮治療組的M1相關(guān)因子iNOS、TNF-α、IL-12p40的表達(dá)都低于白藜蘆醇治療組，感染組和吡喹酮組的M2相關(guān)因子Arg1、 IL-10、TGF-β的mRNA表達(dá)水平高于白藜蘆醇組(P<0.05)。而感染組的iNOS、TNF-α、 IL-12p40的表達(dá)都高于吡喹酮組(P<0.05)，兩組的Arg1、 IL-10、TGF-β的表達(dá)水平?jīng)]有差異(P>0.05)。

Fig 1 Proportions of M1 and M2 cells in liver of mice from different n=15)

Fig 2 The mRNA levels of iNOS, Arg1, TNF-α, IL-12, IL-10, TGF-β in hepatic macrophages of mice from different n=15)

2.3 體外不同處理組M1及其相關(guān)因子，M2及其相關(guān)因子的水平在體外采用不同的處理RAW264.7細(xì)胞實驗去驗證體內(nèi)結(jié)果，如Fig 3，4所示，與PBS處理組相比較，SEA處理組、白藜蘆醇處理組、吡喹酮處理組的M1和M2的比例都明顯增高(P<0.05)。但是白藜蘆醇處理組的M1的比例顯著高于SEA處理組(P<0.01)，相應(yīng)的iNOS、TNF-α、IL-12的分泌水平也高于SEA處理組(P<0.05)。而與SEA處理組比較，白藜蘆醇處理組的M2比例下降(P<0.01)，Arg1、IL-10、TGF-β的分泌水平也明顯下調(diào)(P<0.05)。此外，吡喹酮處理組的M1比例及iNOS、TNF-α、IL-12 的分泌水平也高于PBS組(P<0.05)，但低于白藜蘆醇處理組(P<0.05)。上述的結(jié)果提示白藜蘆醇可能通過上調(diào)M1，下調(diào)M2分化，進(jìn)而調(diào)控Th1/Th2抑制血吸蟲病肝臟病理。

2.4 不同處理組肝臟巨噬細(xì)胞中線粒體的合成和功能研究表明線粒體在巨噬細(xì)胞M1/M2極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，進(jìn)一步探究白藜蘆醇是否通過影響線粒體的合成或者功能調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，檢測了感染9周各組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞中mtDNA、PGC-1α的表達(dá)水平、ATP的產(chǎn)生及基礎(chǔ)耗氧率。如Fig 5所示，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組的巨噬細(xì)胞中mtDNA、PGC-1α的mRNA表達(dá)水平都高于健康對照組(P<0.05)，ATP的產(chǎn)生、基礎(chǔ)耗氧率也多于健康對照組(P<0.01)。同時白藜蘆醇治療組的mtDNA、PGC-1α的水平低于感染組(P<0.05)，低于吡喹酮治療組(P<0.05)。ATP的產(chǎn)生、基礎(chǔ)耗氧量也明顯低于感染組(P<0.01)，低于吡喹酮治療組(P<0.01)。提示白藜蘆醇可能通過抑制線粒體的合成和功能進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞往M2極化，促進(jìn)往M1極化。

Fig 3 Proportions of M1 and M2 cells in groups with different n=15)

Fig 4 Levels of iNOS, TNF-α, IL-12, Arg1, IL-10, TGF-β in groups with different n=6)

Fig 5 The mitochondrial metabolism in macrophages of mice from different n=15)

2.5 體外不同處理組RAW264.7中線粒體的合成和功能為了確證體內(nèi)結(jié)果，同樣采用體外刺激RAW264.7，檢測結(jié)果如Fig 6所示，與PBS處理組相比較，SEA處理組、白藜蘆醇處理組的巨噬細(xì)胞中mtDNA、PGC-1α的mRNA表達(dá)水平、ATP的含量、基礎(chǔ)耗氧量都增高(P<0.05)。但是，白藜蘆醇處理組巨噬細(xì)胞中mtDNA、PGC-1α的mRNA表達(dá)水平、ATP的含量、基礎(chǔ)耗氧率明顯少于SEA處理組(P<0.05)。吡喹酮處理組巨噬細(xì)胞中的mtDNA、PGC-1α的mRNA表達(dá)水平、ATP的含量、基礎(chǔ)耗氧率與SEA組沒有明顯差異(P>0.05)， 但是高于白藜蘆醇處理組(P<0.05)。

3 討論

巨噬細(xì)胞M1/M2極化在多種疾病如腫瘤、炎癥、腦卒中、心血管疾病等的發(fā)病及進(jìn)展中都至關(guān)重要，在臨床上已經(jīng)成為治療相關(guān)疾病的重要策略[11-12]。血吸蟲感染造成的最嚴(yán)重的病理改變是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，趨化各種細(xì)胞在蟲卵周圍形成的肉芽腫及其繼發(fā)的纖維化，因此，巨噬細(xì)胞也在血吸蟲病理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，血吸蟲感染過程中巨噬細(xì)胞向M1極化，產(chǎn)生炎性因子，并可以誘導(dǎo)Th1應(yīng)答，而向M2極化則可以產(chǎn)生抑炎因子，并且誘導(dǎo)Th2應(yīng)答，因而兩者對肝臟病理發(fā)揮相反的作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以調(diào)控Th1/Th2應(yīng)答進(jìn)而發(fā)揮抑制肝臟肉芽腫的作用，但其如何調(diào)控Th1/Th2的機(jī)制并不明確。

基于M1/M2極化對Th1/Th2的調(diào)控效應(yīng)，提示白藜蘆醇可能通過影響M1/M2極化，進(jìn)而調(diào)控Th1/Th2應(yīng)答。結(jié)果如預(yù)想一致，經(jīng)過灌胃白藜蘆醇治療后，日本血吸蟲感染小鼠肝臟的巨噬細(xì)胞中M1(CD11b+F4/80+CD16/32+)的比例顯著上升，而M2(CD11b+F4/80+CD206+)的比例則明顯下降，這與本課題組之前的實驗結(jié)果白藜蘆醇上調(diào)Th1應(yīng)答，下調(diào)Th2應(yīng)答是相一致的，提示白藜蘆醇可能是通過促進(jìn)M1極化，進(jìn)而上調(diào)Th1應(yīng)答，同時抑制M2極化，進(jìn)而下調(diào)Th2應(yīng)答，最終抑制肝臟病理。這證明白藜蘆醇的確是可以調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化改變病理，符合黃文澤等[5]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化并緩解小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。在本研究的血吸蟲感染過程中，白藜蘆醇則是促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化進(jìn)而減輕肝臟病理，究其原因可能在于血吸蟲感染致病機(jī)制的特殊性。有別于其他常規(guī)的炎性病理是由促炎因子導(dǎo)致，血吸蟲的病理則是由抑炎因子介導(dǎo)，兩者的致病機(jī)制不一致。在小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中，激活的信號通路是TLR2/Sirt1/ NF-κB途徑，白藜蘆醇主要抑制這條通路中的信號分子及信號傳遞，從而阻礙促炎因子的產(chǎn)生[13]。而在血吸蟲感染過程中，巨噬細(xì)胞在接受混合抗原SEA刺激后，產(chǎn)生的是抑炎信號通路，促進(jìn)IL-10、TGF-β等抑炎因子的表達(dá)。因此推測，由于兩種模型誘導(dǎo)的信號通路有顯著差別，導(dǎo)致白藜蘆醇發(fā)揮作用的靶點(diǎn)不同，因而發(fā)揮不同的作用，需要進(jìn)一步地進(jìn)行探索。此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)，吡喹酮發(fā)揮抑制M1極化的作用，這與其他課題組發(fā)現(xiàn)的吡喹酮化療4周下調(diào)脾臟中M1極化現(xiàn)象一致[14]。表明吡喹酮不僅可以通過殺蟲減輕血吸蟲感染，同時也可能通過下調(diào)巨噬細(xì)胞M1極化發(fā)揮調(diào)控肝臟病理的作用，但具體的調(diào)控還需進(jìn)一步探尋。

Fig 6 The mitochondrial metabolism in macrophages of groups with different n=6)

巨噬細(xì)胞的M1/M2極化受到多種機(jī)制的調(diào)控。近年的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞代謝尤其是線粒體在M1/M2極化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-10]。已經(jīng)明確在線粒體中發(fā)生的氧化磷酸化通過產(chǎn)生ATP支持M2型巨噬細(xì)胞的極化，而M1型巨噬細(xì)胞的活化可以抑制線粒體功能，阻礙巨噬細(xì)胞往M2型極化。張大勇等[15]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過線粒體延緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老，提示血吸蟲感染中白藜蘆醇也可能通過線粒體調(diào)控M1/M2的極化。與預(yù)想一致，本實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇顯著抑制了線粒體的氧化磷酸化水平導(dǎo)致ATP的產(chǎn)生下降，進(jìn)而抑制M2型極化，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的極化。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠顯著下調(diào)線粒體的數(shù)量，并且是可能通過抑制線粒體合成關(guān)鍵因子PGC-1α的表達(dá)來實現(xiàn)，但具體的機(jī)制還不明確。有文獻(xiàn)報道白藜蘆醇可以通過促進(jìn)線粒體的自噬減少細(xì)胞中多余的線粒體減輕病理，這也可能是本實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇減少巨噬細(xì)胞中線粒體的原因之一，需要進(jìn)一步的探尋[16]。

綜上所述，在血吸蟲感染過程中，白藜蘆醇不僅可以下調(diào)線粒體的功能，還可以減少其合成，從而抑制M2型巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)M1型極化，進(jìn)而上調(diào)Th1、下調(diào)Th2，最終抑制肝臟病理，發(fā)揮其對血吸蟲病的治療效果。本研究為白藜蘆醇調(diào)控巨噬細(xì)胞極化和能量代謝提供可靠的依據(jù)。