李 嬌，路青瑜，郭 麗，李 敏，孫黔云

( 1. 貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，2. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3. 貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

隨著人類生活條件的不斷改善和提高，心血管系統(tǒng)常見疾病的發(fā)病率日趨增高，且有年輕化的趨向，其中動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為上述疾病典型代表之一。AS是一種復(fù)雜的、慢性的炎癥性疾病，是造成心血管疾病高發(fā)病率和死亡率的主要原因[1]，其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)異常增殖是促進AS病變的主要原因[2]。VSMC是附著于血管內(nèi)皮細胞表面的一層細胞，作為構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)、維持血管張力的主要細胞，VSMC異常增殖會誘導(dǎo)細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和相關(guān)功能的改變，是導(dǎo)致AS、高血壓和高脂血癥等多種心血管疾病的細胞病理學(xué)基礎(chǔ)[3]。多種致病因素導(dǎo)致的VSMC活化和功能紊亂是炎癥發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，能誘導(dǎo)VSMC產(chǎn)生炎性細胞因子進一步加重炎性反應(yīng)，在AS發(fā)生和發(fā)展的過程中起關(guān)鍵作用，因此其動態(tài)平衡在組織的穩(wěn)態(tài)中十分重要。多種因素都會導(dǎo)致VSMC增殖活化，例如脂多糖和高氧化低密度脂蛋白等[4-5],據(jù)報道補體激活也可以引起VSMC增殖活化[6-8]。補體是免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分，當(dāng)其被過度激活會導(dǎo)致細胞的炎癥發(fā)生和組織損傷[9-11]。補體的激活主要有3條途徑，每條途徑的激活產(chǎn)物不盡相同，其中旁路途經(jīng)在諸多疾病中都扮演重要角色。對于補體旁路途經(jīng)激活產(chǎn)物致VSMC的影響及作用目前尚不清晰，因此，為進一步認識和了解補體旁路過度激活對VSMC的影響及其相關(guān)病理機制，本文開展了血漿補體旁路途徑激活對VSMC產(chǎn)生的增殖活化作用研究，從一個新的角度和視野為臨床治療AS相關(guān)疾病藥物篩選及評價提供參考依據(jù)和合適的細胞模型。

1 材料

1.1 試劑胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(阿根廷Natocor-Industria Biológica公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；海腎熒光素酶報告質(zhì)粒、NF-κBp65信號通路質(zhì)粒和Dual-Luciferase reporter assy system Kit(美國Promega公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、Lipo6000TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；血漿標(biāo)準品(normal human plasma，NHP)(德國Siemens公司)，貨號為503264C；NHP 經(jīng)56 ℃水浴滅活0.5 h而得滅活人血漿(inactivated normal human plasma，INHP)；眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)由本課題組分離、純化和活力單位測定；Human E-selectin、ICAM-1和VCAM-1 ELISA Kits(武漢博士德生物工程有限公司)；p-NF-κB p65、NF-κB p65、IKK和β-Actin Rabbit mAb(美國CST公司)，貨號分別為3033S、8242S、8943S和4970S；吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)(美國Sigma公司)，貨號為P8765。

1.2 儀器CLM-170B-8-NF CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；連續(xù)波長酶標(biāo)儀Gen5(美國BioTek公司)；化學(xué)發(fā)光檢測儀(美國Promega公司)；Fusion-FX蛋白免疫印跡系統(tǒng)(法國Vilber公司)；TS2FL倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)人血管平滑肌細胞株(VSMC)由南華大學(xué)陳臨溪教授惠贈。VSMC的培養(yǎng)用含0.15比例FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、含5% CO2飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 補體旁路激活物的制備臨用前，將用生理鹽水(Normalsaline，NS)稀釋的CVF(濃度為6.5×104U·L-1)等體積與NHP輕輕混勻，37 ℃恒溫水浴0.5 h制備補體旁路激活產(chǎn)物(CVF-activated complement，CAC)，同時以INHP替代NHP同等條件下孵育制備產(chǎn)物作為對照。

2.3 CAC對VSMC增殖活化的檢測

2.3.1不同量CAC對VSMC細胞增殖的影響 把對數(shù)生長期的VSMC稀釋到7.5×106個·L-1后接種于96孔細胞培養(yǎng)板，種板體積100 μL/孔，24 h后進行換液處理，分別加30 μL、40 μL和50 μL/孔CAC刺激VSMC，于37 ℃刺激24 h后MTT法檢測細胞活力，鏡檢觀察細胞的形態(tài)變化，同時設(shè)置滅活血漿孵育產(chǎn)物對照組(Control)。

2.3.2CAC對不同時間VSMC細胞活力的影響 參照“2.3.1”試驗方法，加入40 μL CAC后，MTT法分別檢測0、6、12、24 h時細胞活力和鏡檢觀察細胞形態(tài)的變化情況，同時設(shè)置滅活血漿孵育產(chǎn)物對照組(Control)。

2.3.3CAC對VSMC黏附分子表達的影響 細胞接種參照“2.3.1”的方法，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后進行換液處理2次，加40 μL CAC后，用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基補齊至100 μL，分別取0、6、12、24 h 細胞培養(yǎng)上清，2 000 r·min-1離心10 min取上清測定相關(guān)黏附分子的含量。

2.3.4CAC對VSMC NF-κB信號通路的影響

2.3.4.1 質(zhì)粒制備 質(zhì)粒制備及濃度測定參照文獻[11]。

2.3.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測CAC對VSMC NF-κB p65核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的影響 將對數(shù)期生長的VSMC稀釋到7.5×106個·L-1濃度進行種板，每孔100 μL，接種于96孔黑色不透光細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，用溫育無血清DMEM高糖培養(yǎng)基進行換液處理，棄上清，每孔分別加入90 μL含血清不含抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基和10 μL轉(zhuǎn)染混合液，按Lipo6000TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書過夜轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后棄去上清，加入40 μL CAC 和60 μL無血清DMEM高糖培養(yǎng)基處理4 h后進行熒光強度的檢測(Model)，以INHP CVF孵育產(chǎn)物作為對照(Control)，具體檢測方法和計算公式參考文獻[11]執(zhí)行。

2.3.4.3 CAC對VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的檢測 將處于對數(shù)期生長的VSMC接種于25 cm2的一次性細胞培養(yǎng)瓶中，接種密度為5×107個·L-1。培養(yǎng)24 h，待細胞鋪滿80%～85%時進行換液處理，模型組(Model)加1.2 mL CAC后，再加1.8 mL無血清DMEM培養(yǎng)基補齊3 mL，分別刺激3 h和24 h后，按照碧云天胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒操作提取胞質(zhì)蛋白，以INHP CVF孵育產(chǎn)物作為對照(Control)。蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜、一抗(1 ∶1 000)過夜孵育和二抗(1 ∶1 000)孵育1 h后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色成像系統(tǒng)進行曝光顯影檢測和量化分析。

2.4 PDTC對CAC誘導(dǎo)VSMC增殖活化的干預(yù)作用

2.4.1PDTC對VSMC細胞活力的影響 參照“2.3.1”方法進行VSMC細胞的種板和培養(yǎng)24 h后，分別加10 μL/孔PDTC預(yù)處理VSMC 2 h，PDTC終濃度分別為：1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7和1.0×10-8mol·L-1，總體積100 μL，于37 ℃刺激24 h后MTT法檢測細胞活力。

2.4.2PDTC對CAC致VSMC增殖的影響 參照“2.4.1”方法，加入PDTC(終濃度分別為：1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol·L-1)，預(yù)孵2 h后加入40 μL/孔CAC刺激24 h，MTT法檢測細胞活力。分別以NS代替PDTC，設(shè)置NHP模型組(Model)和INHP對照組(Control)。

2.4.3PDTC對VSMC黏附分子表達的影響 參照“2.3.3”實驗方法，選取各指標(biāo)表達最高時間點進行PDTC(終濃度1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol·L-1)的干預(yù)檢測，預(yù)孵2 h。以NS代替PDTC，分別設(shè)置Model組和Control組。

2.4.4PDTC對VSMC NF-κB p65核轉(zhuǎn)錄活性的影響 參照“2.3.4.2”方法進行細胞種板和轉(zhuǎn)染，其中干預(yù)組分別加終濃度為1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol·L-1PDTC預(yù)處理2 h，加入CAC 在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中4 h檢測熒光強度，按照相對核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性公式計算Ra值，以NS代替PDTC分別設(shè)置Model組和Control組。

2.4.5PDTC對CAC致VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的影響 參照“2.3.4.3”方法進行蛋白抽提。其中干預(yù)組加1.0×10-5mol·L-1PDTC預(yù)處理2 h，換液后盡量棄去上清，加1.8 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，再加入1.2 mL CAC補齊3 mL，分別刺激3 h和24 h后，抽提胞質(zhì)蛋白。按照Western bolt方法通過蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜、一抗(1 ∶1 000)過夜孵育和二抗(1 ∶1 000)孵育1 h后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色成像系統(tǒng)進行曝光顯影檢測和量化分析。

3 結(jié)果

3.1 補體激活誘導(dǎo)VSMC的增殖活化

3.1.1補體激活誘導(dǎo)對VSMC細胞的增殖作用 如Fig 1所示，CAC能夠刺激VSMC細胞增殖，形態(tài)上細胞體積變大；在量效關(guān)系上，40 μL CAC作用時間24 h時，細胞增殖達到最大，與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，且細胞狀態(tài)變化最明顯。如Fig 2所示隨著刺激時間的延長，細胞活力增加，6 h以后，模型組和對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中24 h時，細胞形態(tài)差異最明顯。

3.1.2CAC誘導(dǎo)VSMC表達黏附分子的作用 如Fig 3所示，CAC能刺激VSMC細胞表達E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。其中ICAM-1、VCAM-1的最大含量作用時間為6 h，E-selectin在12 h表達最高。

3.1.3CAC誘導(dǎo)VSMC NF-κB p65轉(zhuǎn)錄活性上調(diào) CAC作用于VSMC，能夠誘導(dǎo)NF-κB p65核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)ig 4)。

3.1.4CAC對VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的影響 如Fig 5所示，CAC刺激VSMC后，上調(diào)p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的表達，其中IKK蛋白表達在刺激3 h和24 h與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，p-NF-κB p65和NF-κB p65表達在刺激24 h與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 1 Effect of various concentrations of CAC on VSMC cell proliferation n=3)

3.2 PDTC對補體旁路激活致VSMC增殖活化的干預(yù)作用

3.2.1PDTC對CAC致VSMC增殖的影響 5個濃度的PDTC對VSMC細胞活力均有一定的影響，且隨著濃度減小，影響逐漸降低，不同濃度間，1.0×10-4mol·L-1與其他濃度PDTC相比對VSMC細胞活力影響差值較大(Fig 6A)，因此后續(xù)實驗選擇在1.0×10-5mol·L-1以下濃度范圍內(nèi)選擇。Fig 6B的結(jié)果顯示，不同濃度的PDTC均能抑制補體激活物刺激引起的VSMC增殖，使其在570 nm處吸光值降低，抑制效果與模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05，P<0. 01)，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，在細胞形態(tài)上，各組間無明顯變化(Fig 7)。

Fig 2 Effect of CAC on VSMC cell proliferation in a time-dependent manner n=3)

3.2.2PDTC對CAC誘導(dǎo)VSMC表達黏附分子的作用 CAC能刺激VSMC細胞表達E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。當(dāng)經(jīng)PDTC預(yù)處理后，E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的表達均明顯下調(diào)，其中，3個濃度PDTC處理組的E-selectin和ICAM-1與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，F(xiàn)ig 8)；VCAM-1經(jīng)高中兩個濃度PDTC處理后與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 8B)，且各濃度間表現(xiàn)出明顯的劑量關(guān)系。

Fig 3 Expression of adhesion molecules in VSMCs after

3.2.3PDTC對CAC致VSMC NF-κB p65核轉(zhuǎn)錄活性的影響 如Fig 9所示，PDTC能夠明顯下調(diào)CAC刺激VSMC導(dǎo)致的NF-κB p65核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的升高，其中濃度為1.0×10-5mol·L-1組與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 The transcriptional activity NF-κB p65 after exposure of VSMC to CAC n=4)

3.2.4PDTC對CAC致VSMC表達p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK的影響 如Fig 10所示，CAC刺激VSMC后，p-NF-κB p65、NF-κB p65和IKK表達明顯上調(diào)，而PDTC對其表達上調(diào)具有干預(yù)作用，其中，在CAC處理24 h時，與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

4 討論

補體是機體固有免疫系統(tǒng)的重要的組成部分，在AS的誘導(dǎo)和發(fā)展中起著重要作用[11]。當(dāng)其被激活后會產(chǎn)生過敏性毒素C3a、C5a和攻膜復(fù)合物MAC等一系列補體活化產(chǎn)物，可直接激活效應(yīng)細胞產(chǎn)生促炎因子，使機體相關(guān)細胞增殖活化，進一步誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的損傷和平滑肌的收縮，繼而產(chǎn)生炎性反應(yīng)和組織損傷，引起一系列相關(guān)疾病[12]，是引發(fā)炎癥的主要介導(dǎo)因素[13-14]。因此，補體的干預(yù)可為AS的防治提供一種新的思路。我們前期研究結(jié)果表明，CVF激活血清中補體旁路后，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞激活，表現(xiàn)出相關(guān)信號通路的活化，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)和炎性分子表達變化等一系列反應(yīng)[15]。這種通過CVF特異激活補體旁路獲得補體全成分產(chǎn)物的方式與機體病理生理條件下補體過度激活高度相似，為進一步認識補體旁路激活對VSMC的作用提供一個很好的工具。因此，本文利用CVF來特異激活血漿補體旁路，探索補體旁路激活對VSMC增殖活化的影響，為開展防治AS藥物篩選提供一個合適的細胞模型。

在本研究中，補體旁路激活物刺激VSMC后會導(dǎo)致細胞增殖活化、出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化，引起黏附分子的表達上調(diào)，NF-κB p65磷酸化水平增加，NF-κB p65核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性升高，NF-κB p65和IKK蛋白表達增加，NF-κB特異抑制劑PDTC對上述炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的變化均有一定的抑制作用。VSMC表達的黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin在炎癥反應(yīng)中介導(dǎo)炎癥細胞黏附發(fā)揮著十分重要的作用，其表達升高提示VSMC活化。NF-κB是一個主要由p50和p65兩種亞基組成的蛋白二聚體，是活化的細胞中多條信號通路的匯集點，在炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中有著至關(guān)重要的作用[16]。在脂多糖誘導(dǎo)大鼠VSMC炎癥發(fā)生過程中，NF-κB通過調(diào)控介質(zhì)炎癥靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而抑制VSMC的增殖和遷移，在調(diào)節(jié)細胞炎性反應(yīng)和增殖活化中起著重要作用[17]。有研究報道，抑制NF-κB信號通路活化能夠取得較明顯的平滑肌保護作用[18]。本研究中，CAC刺激VSMC后NF-κB p65磷酸化水平增加、NF-κB p65核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性升高、NF-κB p65和IKK蛋白表達明顯上調(diào)，提示當(dāng)VSMC受到CAC刺激后，NF-κB信號通路被激活，調(diào)控黏附分子和p65、IKK蛋白表達上調(diào)，增加NF-κB p65轉(zhuǎn)錄活性應(yīng)答增殖活化信號。因此，上述黏附分子及NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)指標(biāo)表達的上調(diào)提示CAC能夠誘導(dǎo)VSMC增殖活化，可直接導(dǎo)致基于VSMC增殖活化應(yīng)答的炎癥發(fā)生。本文中，采用NF-κB信號通路活化特異抑制劑PDTC能夠明確抑制這些黏附分子和相關(guān)蛋白表達，降低NF-κB p65核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性，表明NF-κB信號通路在補體旁路激活造成VSMC增殖活化中具有重要作用。因此，基于本研究結(jié)果，PDTC通過抑制VSMC NF-κB信號通路活化強度增加和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性升高來下調(diào)黏附分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達，從而抑制VSMC增殖活化，揭示PDTC對補體旁路激活導(dǎo)致的VSMC增殖活化具有一定的干預(yù)作用，可以作為一個有效的陽性藥物。通過本研究確定合適的細胞模型條件，可以用于VSMC增殖抑制的活性物質(zhì)篩選，為下一步從補體的角度去篩選和評價相關(guān)的活性物質(zhì)提供一個新的細胞模型。

Fig 5 Western blot analysis of p-NF-κB p65, NF-κB p65 and IKK protein expressions of VSMC induced by CAC n=4)

Fig 6 Effect of PDTC on cell proliferation n=4)

Fig 7 Effect of PDTC on VSMC morphology induced by CAC(×100)

Fig 8 Effect of PDTC with different concentrations on adhesion molecule expression of VSMC induced by

Fig 9 Effect of PDTC with different concentrations on transcriptional activity of NF-κB p65 after exposure of VSMC induced by CAC n=4)

Fig 10 Effects of PDTC on protein level of p-NF-κB p65, NF-κB p65 and IKK n=4)

綜上，補體旁路激活可以直接導(dǎo)致VSMC增殖活化，上調(diào)表達黏附分子、NF-κB p65核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性和NF-κB信號通路活化，表明補體旁路激活會影響平滑肌細胞的正常功能，產(chǎn)生相關(guān)的病理生理效應(yīng)，提示補體旁路途經(jīng)可能在AS發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色。本研究從一個新的角度和視野為AS的防治藥物篩選提供一個潛在的細胞模型。