王 霧，楊 梅，蔣夢(mèng)雅，汪丹丹，陳鏡宇，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

銀屑病是由多種因素相互作用引起的慢性鱗屑性皮膚病，病程反復(fù)發(fā)作，全球患病率為1%-3%，呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，其中80%以上患者表現(xiàn)為尋常型[1]。近年來(lái)[2]，大量文獻(xiàn)表明Th17分泌的細(xì)胞因子IL-23、IL-17在銀屑病患者皮膚與血清中明顯升高。銀屑病患者JAK/STAT3通路被激活，磷酸化STAT3的表達(dá)較正常人明顯升高。銀屑病臨床治療藥物主要概括為5大類：內(nèi)服藥、外用藥、物理療法、天然植物用藥以及生物制劑。這些藥物的副作用也各不相同，內(nèi)服與外用藥常伴有皮膚萎縮、紅腫、刺痛、瘙癢、灼燒感；物理療法大大增加了患者皮膚癌患病率；新興生物制劑主要針對(duì)中至重度患者，常常伴有嚴(yán)重的感染及價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用得以限制[3]。因此尋求經(jīng)濟(jì)、副作用較少的藥物對(duì)臨床治療銀屑病有重要意義。

人參皂苷CK(ginsenoside metabolite compound K，GCK)是人參中提取的主要生物活性天然化合物，在人腸道菌群水解為Rg2、Rg3、化合物K等，化合物K被認(rèn)為是口服人參或人參皂苷后具有代表性的活性代謝物，發(fā)揮抗炎免疫作用[4]。課題組前期研究表明[5]，GCK在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)動(dòng)物模型中發(fā)揮抗炎免疫作用，其作用機(jī)制與抑制T細(xì)胞的活化，減少Th17的分化有關(guān)。有研究表明[6]，GCK對(duì)咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)的BALB/C小鼠銀屑病模型有改善作用，但作用機(jī)制尚未闡明。另有研究表明[7]，GCK通過(guò)抑制REG3A/RegIIIg的表達(dá)緩解角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖來(lái)減輕IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損。GCK對(duì)銀屑病治療作用與抑制JAK1/2-STAT3通路有無(wú)關(guān)聯(lián)，仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討GCK體內(nèi)用藥對(duì)IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病的療效和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BABL/c小鼠，♂，7-8周，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2017-001，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。所開展的實(shí)驗(yàn)均經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中涉及的方法均根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)指南和法規(guī)進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑GCK(由浙江海正制藥有限公司提供，純度≥98%，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，配制成4個(gè)劑量組)(批號(hào)：S130901)；甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)購(gòu)自信誼藥業(yè)(批號(hào)：036180804)；地塞米松(dexamethasone，DEX)購(gòu)自安徽金太陽(yáng)生化藥業(yè)(批號(hào)：1801192)；BCA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司(批號(hào)：UJ290656)；JAK1一抗(批號(hào)：GR221662-23)、磷酸化JAK1一抗(批號(hào)：GR249635-22)購(gòu)于Abcam；JAK2一抗(批號(hào)：11)、磷酸化JAK2一抗(批號(hào)：10)、STAT3一抗(批號(hào)：4)、磷酸化STAT3一抗(批號(hào)：34)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；PCNA購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司(批號(hào)：E0119)；K1一抗購(gòu)自Proteintech；。EDTA抗原修復(fù)液(批號(hào)：19042401)、免疫組化通用二步法試劑盒(批號(hào)：K196915D)、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于美國(guó)賽默飛(批號(hào)：TG269475)；IMQ乳膏購(gòu)于四川明欣藥(批號(hào)：19030340)；凡士林乳膏購(gòu)于天津市博迪化工有限公司(批號(hào)：11021)；脫毛膏購(gòu)于植物醫(yī)生溫和套裝(批號(hào)：ACG0800604)；Mouse IL-17 ELISA kit(批號(hào)：2001-1)、Mouse IL-23 ELISA kit(批號(hào)：1912-1)購(gòu)于深圳達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器Olympus倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡)；多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)；1 mL玻璃勻漿器(廣州優(yōu)博實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

1.4 銀屑病模型的建立隨機(jī)將BALB/C小鼠分為如下組(每組10只)：正常對(duì)照組、模型組、MTX(2 mg·kg-1)組、DEX(5 mg·kg-1)組、GCK 14、28、56、112 mg·kg-1。造模前3 d，背部脫毛2 cm×3 cm范圍，觀察小鼠背部脫毛情況，進(jìn)行二次脫毛。造模當(dāng)天，除正常對(duì)照組外的小鼠于背部皮膚上涂抹約62.5 mg IMQ乳膏(5%)，正常對(duì)照組小鼠背部涂抹等量凡士林。各給藥組灌胃給藥，正常對(duì)照組小鼠灌等量溶媒，連續(xù)7 d。

1.5 小鼠背部皮膚觀察每日同一時(shí)間段用數(shù)碼照相記錄皮損變化，對(duì)小鼠皮損處3個(gè)指標(biāo)(鱗屑、增厚、紅斑)的程度采用PASI評(píng)分，3者評(píng)分之和為總分。PASI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～4分，分別表示無(wú)、輕度、中度、重度、極重度，總分為3個(gè)指標(biāo)分?jǐn)?shù)之和(0～12分)。d 8小鼠進(jìn)行眼球取血，取脾臟、胸腺和背部皮膚，25%皮膚用4%組織固定液常溫保存，其余組織均放置-80 ℃保存。

1.6 小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察取出固定液中的皮膚，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察，拍照。每張切片隨機(jī)取3處，測(cè)量角質(zhì)層到基底層的垂直距離，統(tǒng)計(jì)分析表皮厚度變化。

1.7 免疫組化檢測(cè)小鼠皮膚中PCNA的表達(dá)將石蠟切片脫蠟水化，封閉，加抗原修復(fù)液進(jìn)行冷修復(fù)，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日室溫放置30 min后，先滴加反應(yīng)增強(qiáng)液室溫反應(yīng)10 min，后滴加二抗，室溫反應(yīng)20 min，DAB顯色5-8 min，蘇木精復(fù)染20 s，脫水，封片，顯微鏡觀察PCNA的表達(dá)情況。

1.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)取凍存的皮膚組織，按照組織裂解液 ∶PMSF ∶磷酸酶抑制=100 ∶1 ∶1比例研磨，14 000×g離心20 min，取上清，BCA蛋白定量；電泳；用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；TPBS配制脫脂牛奶(5%)在37 ℃溫箱中孵育2 h；洗膜，孵育一抗，4 ℃結(jié)合12 h以上；洗膜；37 ℃孵育二抗2 h；洗膜顯影。

1.9 ELISA檢測(cè)小鼠背部皮膚中IL-17、IL-23的表達(dá)按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，在IL-17、IL-23細(xì)胞因子檢測(cè)板中加入樣本(稀釋4倍)或?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品并設(shè)置對(duì)照，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，加檢測(cè)抗體孵育，洗板，加酶孵育，洗板，加入顯色劑顯色反應(yīng)5～30 min后，加終止液使反應(yīng)終止，10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀設(shè)置參考波長(zhǎng)610 nm～630 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm測(cè)出各孔吸光度值，用ELISACALC軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出各只小鼠皮膚中炎癥因子的水平。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚形態(tài)觀察d 1～2，正常對(duì)照組小鼠皮膚均光滑平整；與正常對(duì)照組相比，IMQ誘導(dǎo)的小鼠在d 1就表現(xiàn)出輕微鱗屑，皮膚微微泛紅；d 3鱗屑增多，涉及大面積皮膚，并且出現(xiàn)明顯增厚現(xiàn)象，可見明顯的紅斑；d 5鱗屑分布更加密集，增厚現(xiàn)象進(jìn)一步明顯，紅斑顏色也進(jìn)一步加深；d 7鱗屑幾乎布滿整片背部皮膚，皮膚厚度明顯增加，肉眼可見的紅斑。MTX、DEX組小鼠皮損明顯改善，GCK給藥組小鼠皮膚損傷減輕，見Fig 1。

2.2 GCK對(duì)小鼠皮膚PASI評(píng)分的影響每天同一時(shí)間段用數(shù)碼相機(jī)記錄小鼠皮損情況，據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。小鼠鱗屑、增厚、紅斑評(píng)分在d 1～d 7均持續(xù)升高(P<0.05)。將3者評(píng)分相加得到總分，總分在d 1～d 7內(nèi)持續(xù)升高，各給藥組PASI評(píng)分降低(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 1 Effect of GCK on back skin of mice induced by IMQ n=10)

Fig 2 Effect of GCK on PASI scores of mice induced by n=10)

2.3 GCK對(duì)小鼠組織病理學(xué)及表皮厚度的影響從HE染色中可以看出對(duì)照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)正常，表皮層細(xì)胞只有2-3層。IMQ誘導(dǎo)的小鼠表皮明顯增厚，角化不全，角化過(guò)度，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，顆粒層變薄，棘突延長(zhǎng)等。GCK給藥組可以改善上述變化，見Fig 3。選取HE切片400×的視野，每只小鼠切片選取一個(gè)視野，使用ImageJ軟件在每個(gè)視野中隨機(jī)量取3處表皮的垂直距離，取其平均值。與正常對(duì)照組小鼠相比，IMQ誘導(dǎo)的小鼠表皮厚度明顯增加(P<0.01)，與模型組相比，各給藥組小鼠表皮厚度明顯減小(P<0.05)，見Fig 3。

2.4 GCK對(duì)小鼠表皮中PCNA、K1表達(dá)的影響PCNA可以反映角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖程度。如Fig 4A所示，對(duì)照組小鼠表皮PCNA在表皮基底層少量表達(dá)，IMQ誘導(dǎo)的小鼠表皮PCNA表達(dá)明顯增多，呈多層分布，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加。與IMQ誘導(dǎo)的小鼠相比，給藥組小鼠表皮PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少。皮膚表皮中K1是表皮細(xì)胞正常分化的標(biāo)志。與正常組相比，模型組小鼠皮膚中K1表達(dá)降低；與模型組相比，各給藥組小鼠皮膚中K1表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見Fig 4B。

2.5 GCK對(duì)小鼠皮膚JAK1/2-STAT3信號(hào)通路的影響與正常組相比，模型組小鼠皮膚中磷酸化的JAK1、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，與模型組相比，各給藥組均能降低JAK1、JAK2、STAT3的磷酸化水平(P<0.05)。提示GCK可能抑制JAK1/2-STAT3信號(hào)通路緩解小鼠銀屑病，見Fig 5。

2.6 GCK對(duì)小鼠背部皮膚IL-23、IL-17水平的影響如Fig 6所示，與正常組相比，模型組小鼠皮損中IL-23、IL-17水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠皮損中IL-23、IL-17水平明顯降低(P<0.01)。

3 討論

GCK是具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型活性單體，在我國(guó)已注冊(cè)為1.2類新藥，并已完成RA的臨床前研究和I期臨床試驗(yàn)，目前正在進(jìn)行GCK治療RA的II期臨床試驗(yàn)。結(jié)合臨床前長(zhǎng)期毒性研究和Ⅰ期臨床試驗(yàn)綜合顯示，GCK具有良好的安全性和耐受性[8]。本課題組前期完成了GCK治療RA的臨床前藥效學(xué)評(píng)估，結(jié)果顯示GCK具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制與抑制T細(xì)胞的活化，減少Th17的分化有關(guān)[9-12]。

Fig 3 Effect of GCK on histological changes of skin in mice induced by IMQ

Fig 4 Effect of GCK on expression of PCNA (×200) and keratin1 in skin of mice induced by IMQ n=6)

Fig 5 Effect of GCK on expression of p-JAK1, p-JAK2, and p-STAT3 in skin of mice induced by IMQ n=6)

Fig 6 Effect of GCK on levels of IL-17 and IL-23 in skin of mice induced by IMQ n=6)

銀屑病發(fā)病機(jī)制中，IL-23、IL-17的激活促使炎癥發(fā)生，樹突狀細(xì)胞分泌的IL-23與Th17細(xì)胞上的受體結(jié)合，刺激Th17細(xì)胞分泌IL-17、IL-22等細(xì)胞因子。IL-23不僅可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，還促進(jìn)新生血管生成并募集中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等。銀屑病的許多關(guān)鍵致病介質(zhì)，包括IL-23、IL-17的激活，都與JAK1/2-STAT3信號(hào)通路的活化有關(guān)。與正常皮膚相比，銀屑病患者受損皮膚JAK1/2-STAT3信號(hào)通路上調(diào)[13]。作為銀屑病治療靶標(biāo)的IL-23、IL-17和JAK1/2-STAT3信號(hào)通路已經(jīng)成為新藥開發(fā)的重要方向，靶向抗IL-23、IL-17的藥物對(duì)銀屑病有明顯療效。銀屑病患者給予IL-17受體單克隆抗體、JAK1/2的抑制劑12周后情況明顯改善，通過(guò)阻斷IL-17A與IL-17受體結(jié)合的單抗已陸續(xù)上市[14]。

IMQ乳膏最初用于局部治療由人類乳頭瘤病毒引起的殖器和肛周感染，是一種Toll樣受體7配體，具有強(qiáng)大的免疫激活作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在銀屑病患者使用部位還是未使用部位，IMQ會(huì)加速銀屑病病灶的出現(xiàn)。局部連續(xù)7 d涂抹IMQ構(gòu)建的急性銀屑病模型，增強(qiáng)了IL-23、IL-17及 JAK1/2-STAT3的表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GCK可以降低PASI評(píng)分，改善皮膚鱗屑、增厚、紅斑、角化不全、角化過(guò)度、炎性浸潤(rùn)等皮膚病理狀況，提示GCK對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的治療作用。

表皮正常分化的信號(hào)表現(xiàn)為角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入基底層后，K1開始大量表達(dá)。銀屑病的臨床特征性表現(xiàn)為表皮細(xì)胞異常增生和分化。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組表皮中PCNA表達(dá)明顯增加，K1表達(dá)降低，GCK給藥后，PCNA表達(dá)降低，K1表達(dá)明顯增強(qiáng)；提示GCK可能通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生，促進(jìn)正常分化來(lái)改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的皮膚損傷。進(jìn)一步研究表明，GCK能降低p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)，降低炎癥因子IL-23、IL-17的水平；提示GCK治療IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠可能與下調(diào)IL-23、IL-17，抑制JAK1/2-STAT3活化有關(guān)。

綜上所述，GCK可以緩解IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病損傷，其作用機(jī)制可能與抑制JAK1/2-STAT3活化有關(guān)。GCK作為天然藥物來(lái)源成分，具有耐受性好、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，本研究為治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。