趙 歡 馬小莉 張 萱 韓志峰 劉元濤

(青島大學(xué)附屬青島市立醫(yī)院內(nèi)分泌科，青島 266071)

細(xì)胞凋亡在清除體內(nèi)衰老、惡變細(xì)胞、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。逃避凋亡被認(rèn)為是癌癥的特征性標(biāo)志之一[1]。抑制細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用[2]。凋亡抑制因子(bachlorival IAP repeat-containing protein 5，BIRC5)作為凋亡抑制因子基因家族成員，可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[3]。BIRC5在成熟分化的組織中微量表達(dá)或幾乎不表達(dá)，但在胚胎組織及許多惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)[4]。腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)的BIRC5蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞的轉(zhuǎn)化突變得以保存和積累[5]。BIRC5在腫瘤組織中的過(guò)表達(dá)可激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，導(dǎo)致BIRC5抗體產(chǎn)生[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，在多腫瘤如乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌患者血漿中檢測(cè)到BIRC5抗體的存在，在肺癌患者血漿中也可檢測(cè)到BIRC5抗體表達(dá)[7-12]。作為機(jī)體抗腫瘤體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，BIRC5抗體表達(dá)的意義及其對(duì)肺癌預(yù)后的影響尚不明確。與重組蛋白相比，線性抗原肽具有抗原表位特異性強(qiáng)、非特異性結(jié)合較少等優(yōu)點(diǎn)，利用線性抗原肽檢測(cè)抗體更為經(jīng)濟(jì)、便利，便于大規(guī)模人群篩選。因此，本研究旨在運(yùn)用抗原表位預(yù)測(cè)工具設(shè)計(jì)、合成BIRC5線性抗原肽(BIRC5a、BIRC5b)并應(yīng)用自行建立的ELISA檢測(cè)法，通過(guò)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC) 患者血漿BIRC5抗體表達(dá)水平探討B(tài)IRC5抗體表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象與分組 選取2012年11月至2016年8月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科首次確診、未經(jīng)治療的NSCLC患者211例，均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為NSCLC。其中男性131例，女性80例，平均年齡58.7歲?！?0歲者106例 ，<60歲者105例，腺癌124例，鱗癌87例。根據(jù)2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC肺癌TNM分期，將211例NSCLC患者分為：Ⅰ期 20例，Ⅱ期101例，Ⅲ期41例,Ⅳ期49例。選取同期健康志愿者200例作為正常對(duì)照組，其中男性103例，女性97例，平均年齡58.6歲。兩組年齡、性別、吸煙史無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。于清晨無(wú)菌采集兩組研究對(duì)象外周靜脈血5 ml,置于枸櫞酸鈉抗凝管， 2 500 r/min離心10 min，收集上層血漿，-80℃保存待用。所有受試者知情同意，本研究經(jīng)吉林大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 BIRC5抗原肽委托上海吉爾生化公司合成，96孔酶標(biāo)板為美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體為英國(guó)Abcam公司生產(chǎn)，1.0 mol/L磷酸鹽緩沖液、EDTA、NaCL、Tween 20、L-鹽酸半胱氨酸、磷酸鹽緩沖片、小牛血漿白蛋白均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)，顯色劑及終止液為美國(guó)Life Technologies公司產(chǎn)品，IgG陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為英國(guó)高地與島嶼大學(xué)尉軍教授惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1抗原設(shè)計(jì)、合成 利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和抗原表位預(yù)測(cè)軟件(http://www.iedb.org)全面分析BIRC5氨基酸結(jié)構(gòu)中每條肽段所處的位置及抗原性、親水性、柔性、表面可及性等特性，測(cè)試每條肽段與MHCⅡ分子結(jié)合能力及潛在的B細(xì)胞表位，設(shè)計(jì)2條線性抗原肽(BIRC5a、BIRC5b)，委托上海吉爾生化公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.2.2抗原溶解與包被 用67% 冰乙酸將抗原溶解至工作濃度，即5 mg/ml。嚴(yán)格按照Thermo Fisher Scientific說(shuō)明書(shū)要求包被抗原。

1.2.3ELISA法檢測(cè)BIRC5抗體 0.1%PBST溶液洗滌微孔板2次,血漿標(biāo)本用0.5%BSA 稀釋100 倍后每孔加樣50 μl,室溫孵育1.5 h，洗板3 次后每孔加入用0.5% BSA 1∶50 000稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體50 μl,室溫孵育1 h，洗板3次后每孔加入顯色劑50 μl，室溫避光顯色25 min，最后每孔加入終止液25 μl終止反應(yīng)，在450 nm和620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。每板同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照,各標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔，所有樣品均測(cè)定2次，以特異性結(jié)合指數(shù)(SBR)表示血漿BIRC5抗體水平。SBR=(OD樣品-OD陰性對(duì)照)/(OD陽(yáng)性對(duì)照-OD陰性對(duì)照)。

表1 BIRC5a 與BIRC5b的序列信息

2 結(jié)果

2.1NSCLC患者血漿BIRC5抗體表達(dá)與健康志愿者比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，NSCLC患者血漿BIRC5a抗體表達(dá)水平(1.33±0.53)高于健康對(duì)照組(1.14±0.51，Z=-4.06，P<0.001)。NSCLC患者血漿BIRC5b抗體表達(dá)水平(1.03±0.57)與健康對(duì)照組(0.99±0.58)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.19，P=0.23)。

2.2血漿BIRC5抗體在NSCLC患者中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 BIRC5a抗體在不同性別、年齡、有無(wú)吸煙史、不同腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血漿中表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在不同分化程度、不同組織學(xué)類(lèi)型NSCLC患者血漿中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007，P=0.028,表2)。NSCLC患者血漿BIRC5b抗體表達(dá)與性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)關(guān)(P>0.05)。

2.3生存分析 211例患者術(shù)后均進(jìn)行了規(guī)范化治療。截至最后1次隨訪(2017年12月31日)，共154例完成隨訪，其中52例死亡，隨訪率為73%，隨訪時(shí)間為1.25～63.11個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為26.0個(gè)月。根據(jù)154例成功隨訪的NSCLC患者血漿BIRC5抗體表達(dá)水平的中位數(shù)將NSCLC患者分為BIRC5抗體高表達(dá)組和BIRC5抗體低表達(dá)組。總生存期為NSCLC患者首次診斷至死亡或最后1次隨訪時(shí)間。

2.4NSCLC患者血漿BIRC5抗體表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示與血漿BIRC5b 抗體低表達(dá)組相比，高表達(dá)組NSCLC患者的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)(圖1),BIRC5a 抗體高表達(dá)組與低表達(dá)組相比，患者總生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank檢驗(yàn)，χ2=1.0,P=0.32)。單因素COX回歸分析顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及BIRC5b 抗體水平是影響NSCLC患者總生存期的重要因素。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，BIRC5b抗體表達(dá)為NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(HR=0.49，P=0.012，表3)。

表2 NSCLC患者血漿抗BIRC5抗體表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 影響NSCLC患者預(yù)后變量的單因素及多因素分析

圖1 BIRC5抗體高表達(dá)組和低表達(dá)組NSCLC患者的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.1 Kaplan-Meier survival analysis for anti-BIRC5 IgG high expression and low expression groups in patients with NSCLCNote:A.Anti-BIRC5a IgG;B.Anti-BIRC5b IgG.

3 討論

作為凋亡抑制因子家族的成員，BIRC5可通過(guò)多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡。另外，BIRC5還參與細(xì)胞周期調(diào)控[13]。因此，本研究推測(cè)BIRC5可能參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。已有研究報(bào)道肺癌患者血漿表達(dá)BIRC5抗體，但BIRC5抗體表達(dá)的意義及其在肺癌進(jìn)展中的作用鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示NSCLC患者血漿BIRC5a抗體表達(dá)較健康對(duì)照組顯著上升，且與腫瘤分化程度、組織學(xué)類(lèi)型有關(guān)，而血漿BIRC5b抗體表達(dá)與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究結(jié)論一致。由此證實(shí)，BIRC5抗體參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。由于BIRC5a與BIRC5b為根據(jù)BIRC5蛋白結(jié)構(gòu)不同抗原表位設(shè)計(jì)并合成的抗原多肽，BIRC5a與BIRC5b抗體在NSCLC患者血漿中表達(dá)水平的差異說(shuō)明即使來(lái)源于同一蛋白結(jié)構(gòu)，由于不同抗原表位的免疫原性不同，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力也不同。為通過(guò)預(yù)測(cè)抗原表位進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更靈敏的抗體檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

目前關(guān)于BIRC5的表達(dá)與NSCLC預(yù)后關(guān)系的研究結(jié)論并不一致。VISCHIONI等[14]研究發(fā)現(xiàn)與BIRC5表達(dá)陰性患者相比，BIRC5表達(dá)陽(yáng)性的晚期NSCLC患者總生存期及無(wú)病生存期顯著延長(zhǎng)。FALLENI等[15]認(rèn)為BIRC5不能預(yù)測(cè)NSCLC患者的預(yù)后。HUANG等[16]研究結(jié)果顯示BIRC5表達(dá)與接受鉑類(lèi)化療的晚期NSCLC患者的預(yù)后不良有關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)BIRC5抗體表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，雖然BIRC5b抗體的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等通常提示患者預(yù)后不良的因素均無(wú)關(guān)，但血漿BIRC5b抗體高表達(dá)組較低表達(dá)組術(shù)后生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)。因此，推測(cè)NSCLC患者血漿過(guò)度表達(dá)的BIRC5b抗體可能抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。在肺癌的發(fā)展過(guò)程中，隨BIRC5基因表達(dá)上調(diào)，BIRC5蛋白分泌量逐漸增多，異常表達(dá)的BIRC5蛋白刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生BIRC5抗體。作為機(jī)體抗腫瘤體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，BIRC5抗體的表達(dá)可能是機(jī)體免疫系統(tǒng)阻止肺癌進(jìn)展的一種嘗試，通過(guò)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)清除過(guò)量的BIRC5蛋白，遏制BIRC5蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)作用。同時(shí)BIRC5b抗體的表達(dá)也為NSCLC患者的預(yù)后評(píng)估提供了潛在參考指標(biāo)。

綜上，BIRC5a抗體在NSCLC患者血漿中呈高表達(dá)，但其表達(dá)與NSCLC預(yù)后無(wú)關(guān)；血漿BIRC5b抗體高表達(dá)組的NSCLC患者較BIRC5b抗體低表達(dá)組的NSCLC患者術(shù)后生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，提示BIRC5b抗體表達(dá)可能在一定程度上抑制肺癌發(fā)生發(fā)展，其有望成為預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。