張彐寧 高維娟 周曉紅 靳曉飛

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗室，石家莊 050091)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病治療過程中常見的病理損傷，如何減輕該損傷已成為臨床及科研領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。再灌注導(dǎo)致的病理損傷機(jī)制主要為細(xì)胞凋亡、氧自由基生成過多、Ca2+超載、自噬等[1-2]。細(xì)胞凋亡作為腦缺血后再灌注引發(fā)二次損傷的重要作用機(jī)制，主要表現(xiàn)形式包括內(nèi)源性線粒體凋亡途徑和外源性死亡受體途徑，其中線粒體凋亡通路是再灌注凋亡發(fā)生的主要途徑[3-4]。凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)是線粒體凋亡通路中連接上下游調(diào)控因子的關(guān)鍵中間蛋白，對細(xì)胞凋亡調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中，通過藥物干預(yù)抑制Apaf-1表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞凋亡，減輕腦組織損傷[6]。但在細(xì)胞水平的相關(guān)研究較少，而采用基因沉默靶向抑制Apaf-1表達(dá)，準(zhǔn)確觀察其對腦缺血再灌注線粒體凋亡通路的影響研究更少。本研究采用PC12細(xì)胞建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型，模擬神經(jīng)細(xì)胞體外缺血再灌注損傷環(huán)境，靶向抑制Apaf-1蛋白表達(dá)，在細(xì)胞水平探討Apaf-1對氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響，為腦缺血再灌注損傷的靶向治療提供新的思路和實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)購自BOSTER公司，經(jīng)NGF誘導(dǎo)后具有神經(jīng)元特性。

1.1.2主要試劑與儀器 opti-MEMⅠ培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；Apaf-1-siRNA(廣州銳博)；CCK-8試劑盒(北京莊盟)；TUNEL試劑盒、AnnexinV-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)；Bax、Bcl-2抗體(武漢Servicebio公司)；Apaf-1、caspase-9、caspase-3單克隆抗體(美國CST公司)；DMEM培養(yǎng)基、Earle′s平衡鹽溶液(安徽雷根)。SW-CJ-ID型超凈工作臺(蘇州凈化)；3111型CO2培養(yǎng)箱、 Multiskan FC型酶標(biāo)儀、3131型三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；多功能成像系統(tǒng)(Vilber)；Axio Observer 7型倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)；FC 500 MCL型流式細(xì)胞儀(Beckman)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與Apaf-1轉(zhuǎn)染 PC12細(xì)胞采用含10%胎牛血清+1%雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時進(jìn)行傳代。采用對數(shù)生長期PC12細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d，采用含10%胎牛血清不加雙抗的培養(yǎng)基以5×105個/孔接種于6孔板，次日細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按照siRNA說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染6 h后更換為DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24 h于倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(Apaf-1表達(dá)水平)，48 h后采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率，設(shè)置NC-siRNA、Apaf-1-siRNA1、Apaf-1-siRNA2、Apaf-1-siRNA3 4組篩選合適的siRNA干擾Apaf-1基因，轉(zhuǎn)染成功后造模。

1.2.2實(shí)驗分組與模型建立 實(shí)驗分為3組：正常組(Control)、模型組(Model)及Apaf-1基因沉默組(Apaf-1-siRNA)。 Control組細(xì)胞不做任何處理，其余各組氧糖剝奪2 h、復(fù)氧復(fù)糖24 h造模。造模過程：取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，去除正常培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，更換為無糖Earle′s平衡鹽溶液，37℃、飽和濕度、94%N2+1%O2+5%CO2培養(yǎng)2 h，即氧糖剝奪2 h，Model組和Apaf-1-siRNA組更換為正常培養(yǎng)基，放入CO2中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即復(fù)氧復(fù)糖24 h。

1.2.3熒光標(biāo)記的siRNA檢測Apaf-1轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染前1 d，將PC12細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板，細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用opti-MEMⅠ培養(yǎng)基冰上稀釋lipo 2000 Cy3-siRNA貯存液，室溫靜置5 min，混勻，室溫靜置20 min，加入6孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。

1.2.4Western blot檢測siRNA干擾對PC12細(xì)胞Apaf-1表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，造模后取出各組PC12細(xì)胞，按比例加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，300 mA恒流1.5 h濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Apaf-1(1∶500)一抗，4℃孵育過夜，TBST洗5 min×3次，洗去一抗，加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光液浸泡，多功能成像系統(tǒng)掃描成像，Image J軟件分析條帶，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)。

1.2.5CCK-8檢測細(xì)胞存活率 采用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，除Control組外，其余各組均進(jìn)行氧糖剝奪2 h、復(fù)氧復(fù)糖24 h造模處理，按比例加入CCK-8試劑，置于CO2培養(yǎng)箱孵育50 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。

1.2.6TUNEL染色檢測各組細(xì)胞凋亡指數(shù) 采用12孔板培養(yǎng)細(xì)胞爬片，造模后取出各組細(xì)胞爬片，固定、破膜，PBS清洗爬片，甩掉清洗液，除Control組外，其余各組滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液(TdT∶dUTP=1∶9)，Control組僅加入50 μl dUTP，37℃避光孵育10 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，隨機(jī)選取6個視野觀察各組細(xì)胞凋亡情況。陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)細(xì)胞核為棕黃色。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞培養(yǎng)、造模后，收集培養(yǎng)基，胰蛋白酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗3次，1 500 r/min離心5 min，加入100 μl 1×Binding Buffer緩沖液重懸細(xì)胞，加入FITC和PI各5 μl，室溫避光孵育15 min，篩網(wǎng)過濾，加入400 μl 1×Binding Buffer緩沖液，F(xiàn)C 500 MCL型流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.8免疫熒光染色檢測Bax/Bcl-2比值 取各組細(xì)胞爬片清洗固定，0.2%Triton X-100破膜，山羊血清封閉0.5 h，甩干封閉液，加入Bax與Bcl-2一抗混合液，濕盒內(nèi)4℃過夜，PBS洗去一抗，室溫封閉二抗混合液1 h，洗去二抗，滴加DAIP染液，室溫孵育15 min，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析Bax與Bcl-2熒光強(qiáng)度。

1.2.9Western blot檢測Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá) 造模完成后分別收集細(xì)胞上清，消化裂解，提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，90 V恒壓電泳分離蛋白，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBST洗去一抗，室溫孵育二抗1 h，TBST洗去二抗，化學(xué)發(fā)光液浸泡3 min，多功能成像系統(tǒng)掃描成像，Image J軟件分析條帶，以β-actin為內(nèi)參，計算目的條帶、內(nèi)參相對表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1熒光標(biāo)記的siRNA檢測Apaf-1轉(zhuǎn)染效率 siRNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞24 h后，Apaf-1-siRNA組85%以上細(xì)胞表達(dá)紅色熒光，見圖1。

2.2siRNA干擾對PC12細(xì)胞Apaf-1表達(dá)的影響 與對照組相比，轉(zhuǎn)染Apaf-1-siRNA1、Apaf-1-siRNA2、Apaf-1-siRNA3的各組細(xì)胞Apaf-1蛋白表達(dá)降低，且以Apaf-1-siRNA1組降低最為顯著(P<0.05)。因此采用Apaf-1-siRNA1組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗，見圖2。

2.3CCK-8檢測細(xì)胞存活率 與Control組相比，Model組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)，與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細(xì)胞存活率明顯提高(P<0.05)，見圖3。

圖1 紅色熒光標(biāo)記的siRNA檢測Apaf-1轉(zhuǎn)染效率(×200)Fig.1 Detection of transfection efficiency of Apaf-1 by siRNA labeled with red fluorescence(×200)

圖2 Western blot檢測各組Apaf-1轉(zhuǎn)染效率Fig.2 Western blot detected Apaf-1 transfection efficiency in each groupNote:*.P<0.05 vs NC-siRNA；#.P<0.05 vs siRNA2 and siRNA3.

圖3 CCK-8檢測各組PC12細(xì)胞存活率Fig.3 CCK-8 detection of PC12 cell survival rate in each groupNote:*.P<0.05 vs Control；#.P<0.05 vs Model.

圖4 TUNEL染色檢測各組PC12細(xì)胞凋亡指數(shù)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組PC12細(xì)胞凋亡率Fig.5 Flow cytometry to detect apoptosis rate of PC12 cells in each groupNote:*.P<0.05 vs Control；#.P<0.05 vs Model.

2.4TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡指數(shù) 與Control組相比，Model組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.05)，與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)，見圖4。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 與Control組相比，Model組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖5。

2.6免疫熒光檢測細(xì)胞Bax/Bcl-2比值 與Control組相比，Model組細(xì)胞Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細(xì)胞Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05)，見圖6。

2.7Western blot檢測細(xì)胞Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達(dá) 與Control組相比，Model組線粒體凋亡通路關(guān)鍵蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達(dá)明顯升高

圖6 免疫熒光檢測各組PC12細(xì)胞Bax/Bcl-2比值

圖7 Western blot檢測各組PC12細(xì)胞Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)Fig.7 Western blot to detect of Apaf-1，caspase-9 and caspase-3 protein expression in PC12 cellsNote:*.P<0.05 vs Control；#.P<0.05 vs Model.

3 討論

線粒體凋亡通路中最重要的是caspase途徑，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。其發(fā)生過程主要是線粒體釋放CytC、AIF、核酸內(nèi)切酶G等凋亡誘導(dǎo)因子，其中CytC與細(xì)胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合，促使Apaf-1寡聚化，形成CytC-Apaf-1-caspase-9復(fù)合物，即凋亡小體，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Apaf-1作為連接上下游調(diào)控因子的中間蛋白，在凋亡啟動過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。caspase-9通過改變分子構(gòu)象而自我激活，被切割，激活效應(yīng)caspase，如caspase-3和caspase-7，導(dǎo)致廣泛的蛋白質(zhì)分解和細(xì)胞凋亡[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡發(fā)展過程中，盡管凋亡因子被激活，但仍在一定程度上處于受控狀態(tài)，Apaf-1作為調(diào)控因素，其表達(dá)水平是線粒體凋亡通路的限制因素之一[13]。以Apaf-1為中心的凋亡小體形成是凋亡發(fā)展過程中的關(guān)鍵事件，可激活下游caspase級聯(lián)反應(yīng)。低水平的Apaf-1蛋白在線粒體凋亡誘導(dǎo)因子緩慢釋放的條件下，可能被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)屏障，使細(xì)胞避免凋亡[14]。

VAIBHAV等[15]采用大鼠大腦中動脈閉塞模型在大鼠體內(nèi)模擬腦缺血再灌注損傷環(huán)境，探討Apaf-1在腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體凋亡通路中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織明顯梗死，線粒體通路關(guān)鍵凋亡蛋白Apaf-1表達(dá)上調(diào)，caspase-3和caspase-9活性明顯增強(qiáng)，藥物干預(yù)抑制Apaf-1表達(dá)可顯著降低激活的caspase-3和caspase-9水平，明顯減小腦梗死體積，減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能障礙，表明Apaf-1介導(dǎo)的線粒體凋亡通路在調(diào)控大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Apaf-1不僅在哺乳動物細(xì)胞線粒體凋亡通路中發(fā)揮引擎作用，在昆蟲體內(nèi)Apaf-1同樣具有重要作用。晏琳等[16]通過靶向沉默斜紋夜蛾細(xì)胞中一種新的Apaf-1(S1-Apaf-1)觀察S1-Apaf-1對線粒體凋亡通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)S1-Apaf-1蛋白表達(dá)可顯著降低細(xì)胞凋亡率，證實(shí)Apaf-1在調(diào)控線粒體凋亡通路中扮演關(guān)鍵角色。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖處理后，凋亡蛋白CytC、caspase-3、caspase-9表達(dá)均明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯升高，其作用機(jī)制可能與激活線粒體凋亡通路相關(guān)。但Apaf-1作為線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其在氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞線粒體凋亡通路中的具體作用尚未明確。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，通過基因沉默靶向抑制Apaf-1表達(dá)，探討Apaf-1對氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Apaf-1基因后，線粒體凋亡通路關(guān)鍵蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)，Bax/Bcl-2比值降低，細(xì)胞凋亡指數(shù)和凋亡率明顯降低，細(xì)胞存活率明顯升高。表明靶向抑制Apaf-1表達(dá)可有效抑制氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，發(fā)揮保護(hù)作用。本研究通過基因沉默靶向抑制Apaf-1表達(dá)，精準(zhǔn)調(diào)控線粒體凋亡通路，在細(xì)胞水平探討了Apaf-1對腦缺血再灌注線粒體凋亡通路的影響，為腦缺血再灌注損傷的靶向治療提供了新的思路。