慕德宏 劉慧霞 李東棋 劉 婷 丁 鵬 田 理

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610072)

過敏性鼻炎西醫(yī)學(xué)又稱為變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，是IgE介導(dǎo)的與過敏原相關(guān)的非特異性炎癥[1]。流行病學(xué)研究表明，AR發(fā)病率逐年上升，影響全世界高達(dá)40%的人口[2]。AR易復(fù)發(fā)、易伴隨并發(fā)癥，是變態(tài)反應(yīng)性疾病研究熱點(diǎn)，已成為全球性健康問題。鼻噴劑是臨床治療AR的重要劑型之一，《靈樞·雜病第二十六》即有提及“哆以草刺鼻，嚏而已”，吳師機(jī)所撰《理瀹駢文》已形成較為完整的鼻腔給藥理論體系，其“外治之理即內(nèi)治之理”為克敏芪丹鼻噴劑治療AR提供了理論基礎(chǔ)。純中藥克敏芪丹鼻噴霧劑(益氣活血法)是田理教授基于“肺心同治”和經(jīng)驗(yàn)方劑治療AR的有效方劑，臨床研究表明其對AR癥狀控制及預(yù)防復(fù)發(fā)有顯著優(yōu)勢，為開發(fā)純中藥鼻用新制劑奠定了基礎(chǔ)[3]。本實(shí)驗(yàn)采用克敏芪丹鼻噴霧劑治療氣虛血瘀證AR大鼠，對克敏芪丹鼻噴霧劑的作用機(jī)制，并對其藥物組成進(jìn)行簡單探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 7～8周齡SPF級SD大鼠65只，體質(zhì)量(230±10)g，由成都達(dá)碩動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。(23±2)℃、相對濕度(50±5)%條件下飼養(yǎng)，保持室內(nèi)安靜，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥物 卵清蛋白(OVA，批號：A5503-5G，1 g/瓶)購自Sigma-Aldrich公司；氫氧化鋁購自哈藥集團(tuán)生物制藥有限公司；克敏芪丹鼻噴劑由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供；內(nèi)舒拿鼻噴劑購自默沙東公司。

1.1.3試劑與儀器 0.5%OVA Al(OH)3溶液配制：稱取卵清蛋白50 μg+氫氧化鋁粉末5 mg+生理鹽水1 ml混勻備用；0.6%OVA生理鹽水配制：稱取60 mg OVA至10 ml生理鹽水中，混勻備用。IL-4和PAF ELISA試劑盒購自ThermoFisher公司；全自動血流變儀購自北京普利生儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1氣虛血瘀證AR大鼠模型的建立及分組 大鼠造模分為冷水力竭游泳制造氣虛血瘀證及腹腔注射與鼻腔滴注OVA激發(fā)AR 2個階段[4]。采用游泳力竭法+寒濕+高脂飲食法構(gòu)建氣虛血瘀證模型，先將大鼠進(jìn)行為期1周的游泳訓(xùn)練，2 d/次，2～3 min/次，以適應(yīng)游泳環(huán)境。8℃冷水進(jìn)行力竭游泳造模，連續(xù)14 d，力竭標(biāo)準(zhǔn)為全組50%大鼠出現(xiàn)自然沉降，達(dá)標(biāo)后全組大鼠停止游泳，同時高脂飼養(yǎng)。14 d后，大鼠毛色發(fā)黃，毛發(fā)粗糙，體型瘦弱，情緒暴躁，大便松散不成型；無創(chuàng)血壓儀測量大鼠收縮壓(systolic pressure，SBP)、平均動脈壓(mean blood pressure,MBP)和舒張壓(diastolic pressure,DBP)均不同程度地下降。大鼠由于長時間游泳體力消耗，腦組織處于嚴(yán)重缺氧狀態(tài)，長久致氣虛；因處于冷水環(huán)境中，血液遇寒則凝，致血瘀；氣行血，氣虛無力推動血液運(yùn)行致血瘀。

腹腔注射0.5%OVA Al(OH)3混懸液誘導(dǎo)過敏，2 d/次，共14 d；空白組給予Al(OH)330 mg+生理鹽水1 ml混懸液，2 d/次，共7次。全身抗原攻擊完成后，滴鼻給予0.6%OVA生理鹽水，每只每側(cè)50 μl，1 d/次，共7次?？瞻捉M給予等量生理鹽水。30 min內(nèi)觀察大鼠是否出現(xiàn)搔鼻、噴嚏、鼻溢液及覓食等行為。造模完成后觀察大鼠有無懶動、脫毛、易驚、便溏、舌底紫暗、眼球暗紅等氣虛血瘀癥狀及撓鼻、打噴嚏、流涕等AR癥狀，空白組和模型組各取5只大鼠抽血檢測血液流變學(xué)指標(biāo)。根據(jù)鼻部癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)對鼻炎癥狀進(jìn)行評分:鼻癢，輕擦鼻，記1分;到處摩擦，抓撓鼻、面部不止，記2分;噴嚏1～3個記1分，4～10個記2分，11個以上記3分;鼻涕流至前鼻孔記1分，超過前鼻孔記2分，流涕滿面記3分[5]。通過舌色和舌底靜脈長度觀察舌狀態(tài)。無紫暗，舌底色微青、舌靜脈主干長度不超過3/4,記0分;輕度紫暗，舌底色紫暗或舌靜脈主干長度超過3/4,記1分;明顯紫暗，舌底色紫暗且舌靜脈主干長度超過3/4,記2分[6]。便溏亦為氣虛血瘀證常見癥狀。對大鼠便溏狀況擬定的評分標(biāo)準(zhǔn)如下：大便成形,糞質(zhì)柔軟,記0分;輕度異常，糞便稀溏部分不成形,記1分;明顯異常，糞便稀溏完全不成形,記2分?？偡侄嘤?分為造模成功。大鼠分為空白對照組、模型組、中藥低量組、中劑量組、高劑量組和西藥組。

1.2.2給藥方法 滴鼻給予各中藥組大鼠我院自制克敏芪丹鼻噴劑(0.010 8、0.021 6、0.043 2 g/ml)，主要含黃芪、川芎等藥物，每側(cè)鼻孔滴注1次。西藥組滴鼻給予內(nèi)舒拿鼻噴劑5 μl，每側(cè)鼻孔滴注1次，連續(xù)給藥14 d?？瞻捉M正常攝食飲水，模型組給予高脂飼料，并為正常飲食量的1/3，不限水，直至造模結(jié)束。

1.2.3標(biāo)本采集 于末次給藥后24 h取全血5 ml，3 000 r/min離心15 min，置于潔凈干燥玻璃試管中密封，-20℃保存。組織標(biāo)本制定：去除大鼠下頜骨上頜骨外周皮膚及周圍軟組織，沿鼻中隔軟骨和骨交界處以冠狀面切開部分鼻軟組織，鼻背正中切開，取出鼻中隔及鼻腔外側(cè)壁呼吸區(qū)黏膜組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)切片并進(jìn)行HE染色。

1.2.4指標(biāo)檢測 觀察大鼠有無搔鼻、噴嚏、鼻溢液等AR典型癥狀。HE染色后在顯微鏡下觀察大鼠鼻黏膜病理改變。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清IL-4、PAF含量，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較采用單因素方差分析。方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)觀察 空白組和模型組各隨機(jī)取5只大鼠進(jìn)行血液流變學(xué)檢測，見表1，與對照組相比，模型組大鼠低切、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高(P<0.05)，中切及高切差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)合大鼠AR癥狀判定可繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時用藥階段仍進(jìn)行游泳及OVA滴注以維持造模。

表1 大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)Tab.1 Serum rheological parameters of

2.2大鼠行為及體征觀察 各組治療前與空白對照組評分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥7 d后，中藥各劑量組和西藥組大鼠評分均降低，除中藥低劑量組外均與給藥前差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥14 d后，中藥各劑量組和西藥組大鼠評分繼續(xù)降低，與給藥7 d后評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各治療組給藥7、14 d評分均有不同程度改善，與對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中中藥高劑量組、西藥組改善最為顯著，與中藥低量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 給藥后第1、7、14天大鼠行為及體征評分分)Tab.2 Behavioral and physical signs scores of rats at 1,7 and 14 d after

2.3鼻黏膜病理學(xué)觀察 空白對照組大鼠鼻黏膜組織完整，黏膜上皮各層細(xì)胞排列較整齊，偶見脫落，固有層可見腺管和散在血管，間質(zhì)無水腫變性;模型組大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，AR氣虛血瘀證中藥高量組大鼠鼻黏膜上皮部分完整，纖毛柱狀上皮排列較整齊，固有層結(jié)構(gòu)較清晰，中、低劑量組固有層內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞增生肥厚及變性、邊緣不清，低劑量組尤甚；西藥組可見少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞散在分布于固有層或黏膜上皮，結(jié)構(gòu)基本完整。見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜病理切片HE染色圖(×400)Fig.1 HE staining figure of pathological sections of nasal mucosa of rats in each group(×400)

2.4大鼠血清IL-4、PAF表達(dá)比較 如表3所示，造模后模型組大鼠血清IL-4、PAF水平明顯上升，與空白組大鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；用藥14 d后，中藥各劑量組、西藥組大鼠血清IL-4指標(biāo)水平較模型組下降，其中中藥高劑量組、西藥組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各治療組PAF水平均有所下降，但僅有中藥高劑量組PAF既與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，又與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清IL-4、PAF水平Tab.3 IL-4 and PAF levels of rats of each

3 討論

IL是一組由多種細(xì)胞分泌的、結(jié)構(gòu)和功能各異的可溶性蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及免疫活性等作用[7]。AR是發(fā)生于鼻黏膜的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，是以IgE為主導(dǎo)、多種細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞參與的非特異性炎癥反應(yīng)[8]。IL-4主要由活化的Th2細(xì)胞分泌，是IgE的特異性誘導(dǎo)劑[9]。IgE與變應(yīng)原結(jié)合產(chǎn)生以Th2細(xì)胞免疫為主導(dǎo)的病理改變，導(dǎo)致鼻黏膜血管擴(kuò)張、清水樣鼻腔分泌物增多，黏膜蒼白水腫[10]。IL-4作用于膽堿能神經(jīng)導(dǎo)致腺體分泌旺盛、清水樣鼻腔分泌物，作用于感覺神經(jīng)導(dǎo)致鼻癢、打噴嚏等相關(guān)AR癥狀[11]。提示IL-4含量與鼻黏膜炎癥程度及機(jī)體過敏狀態(tài)相關(guān)。血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)可引起血管通透性增加，滲出增多，促進(jìn)炎癥物質(zhì)釋放，還可誘導(dǎo)血小板聚集，是AR發(fā)病的另一重要炎癥介質(zhì)。正常情況下，PAF在體內(nèi)含量較低[12，13]。AR患者由于長期變應(yīng)原刺激，不但使PAF濃度升高，還會使其活性增強(qiáng)[14]。

克敏芪丹鼻噴劑由黃芪、防風(fēng)、川芎等組成，補(bǔ)益脾肺，扶正氣，固護(hù)衛(wèi)表，黃芪味甘、溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表之效；川芎辛、溫，入心包經(jīng)，有活血化瘀，兼行氣之能，被譽(yù)為“血中氣藥”，其合用有“補(bǔ)氣而不閉邪，活血而不傷正氣”之特點(diǎn)，共奏益氣活血通竅之功效。AR氣虛血瘀證患者鼻腔內(nèi)黏膜水腫，分泌物增多，使鼻腔內(nèi)組織處于持續(xù)炎癥浸潤，導(dǎo)致血管通透性增高，加重局部癥狀[15]。采用益氣活血鼻噴劑直接作用于上皮細(xì)胞被破壞的鼻黏膜(靶器官)，可緩解鼻內(nèi)缺血缺氧癥狀，使毛細(xì)血管通透性降低，炎癥介質(zhì)、IL-4減少，血液循環(huán)通暢，氣滯血瘀癥狀減輕。

相關(guān)研究表明，黃芪可改善機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，減輕致敏狀態(tài)，阻止炎癥介質(zhì)釋放，降低血清IL-4含量，可能與黃芪有效成分對免疫功能的雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)[16]。黃芪多糖為黃芪的主要成分，可促進(jìn)免疫細(xì)胞如T細(xì)胞分化成熟，保護(hù)心肌及抗氧化，進(jìn)而起抗炎作用。黃芪多糖在體外還能明顯抑制 ADP 誘導(dǎo)的兔血小板聚集，300 mg/L時抑制作用最強(qiáng)，原因可能為通過抑制血小板聚集，進(jìn)而降低血清PAF含量[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，克敏芪丹鼻噴劑和內(nèi)舒拿均可有效且持續(xù)地緩解AR的典型癥狀。HE染色結(jié)果說明，克敏芪丹鼻噴劑對AR引起的炎癥因子釋放、水腫、血管通透性下降等癥狀均有良好的緩解作用。2種藥物均能改善AR大鼠血清IL-4水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對單純性AR療效大致相同。經(jīng)克敏芪丹鼻噴劑治療后，PAF水平相較于模型組有所下降，更接近空白組，而西藥組則沒有這個效果。說明對PAF水平的改善克敏芪丹鼻噴劑優(yōu)于內(nèi)舒拿，由于其兼有益氣活血作用，對氣虛血瘀證AR的治療優(yōu)于內(nèi)舒拿。

由于造模周期短、強(qiáng)度不夠、抽取樣本量較少等原因，血液流變學(xué)指標(biāo)中切、高切未表現(xiàn)出明顯差異，但由于用藥階段維持造模，血液流變學(xué)其他指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，行為學(xué)及體征評分統(tǒng)計(jì)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可認(rèn)為造模成功，模型組PAF水平與空白組具有顯著差異也可說明這一點(diǎn)。

克敏芪丹鼻噴劑作為田理教授結(jié)合臨床用藥治療AR的純中藥鼻噴劑，目前對其研究及推廣還比較少。本研究通過與內(nèi)舒拿鼻噴劑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)克敏芪丹鼻噴劑對AR具有良好的療效，對氣虛血瘀證AR效果更佳。臨床證據(jù)顯示，克敏芪丹鼻噴劑治療人體氣虛血瘀證AR的療效與內(nèi)舒拿療效相當(dāng)，但克敏芪丹鼻噴霧劑在緩解氣虛血瘀癥狀方面優(yōu)于內(nèi)舒拿，推測可能與中藥作用于整個機(jī)體有關(guān)[3]。