慕德宏 劉慧霞 李東棋 劉 婷 丁 鵬 田 理
(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,成都 610072)
過敏性鼻炎西醫(yī)學又稱為變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR),是IgE介導的與過敏原相關(guān)的非特異性炎癥[1]。流行病學研究表明,AR發(fā)病率逐年上升,影響全世界高達40%的人口[2]。AR易復(fù)發(fā)、易伴隨并發(fā)癥,是變態(tài)反應(yīng)性疾病研究熱點,已成為全球性健康問題。鼻噴劑是臨床治療AR的重要劑型之一,《靈樞·雜病第二十六》即有提及“哆以草刺鼻,嚏而已”,吳師機所撰《理瀹駢文》已形成較為完整的鼻腔給藥理論體系,其“外治之理即內(nèi)治之理”為克敏芪丹鼻噴劑治療AR提供了理論基礎(chǔ)。純中藥克敏芪丹鼻噴霧劑(益氣活血法)是田理教授基于“肺心同治”和經(jīng)驗方劑治療AR的有效方劑,臨床研究表明其對AR癥狀控制及預(yù)防復(fù)發(fā)有顯著優(yōu)勢,為開發(fā)純中藥鼻用新制劑奠定了基礎(chǔ)[3]。本實驗采用克敏芪丹鼻噴霧劑治療氣虛血瘀證AR大鼠,對克敏芪丹鼻噴霧劑的作用機制,并對其藥物組成進行簡單探討,現(xiàn)報道如下。
1.1材料
1.1.1實驗動物 7~8周齡SPF級SD大鼠65只,體質(zhì)量(230±10)g,由成都達碩動物有限公司提供,許可證號:SCXK(川)2015-030。(23±2)℃、相對濕度(50±5)%條件下飼養(yǎng),保持室內(nèi)安靜,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。
1.1.2藥物 卵清蛋白(OVA,批號:A5503-5G,1 g/瓶)購自Sigma-Aldrich公司;氫氧化鋁購自哈藥集團生物制藥有限公司;克敏芪丹鼻噴劑由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供;內(nèi)舒拿鼻噴劑購自默沙東公司。
1.1.3試劑與儀器 0.5%OVA Al(OH)3溶液配制:稱取卵清蛋白50 μg+氫氧化鋁粉末5 mg+生理鹽水1 ml混勻備用;0.6%OVA生理鹽水配制:稱取60 mg OVA至10 ml生理鹽水中,混勻備用。IL-4和PAF ELISA試劑盒購自ThermoFisher公司;全自動血流變儀購自北京普利生儀器有限公司。
1.2方法
1.2.1氣虛血瘀證AR大鼠模型的建立及分組 大鼠造模分為冷水力竭游泳制造氣虛血瘀證及腹腔注射與鼻腔滴注OVA激發(fā)AR 2個階段[4]。采用游泳力竭法+寒濕+高脂飲食法構(gòu)建氣虛血瘀證模型,先將大鼠進行為期1周的游泳訓練,2 d/次,2~3 min/次,以適應(yīng)游泳環(huán)境。8℃冷水進行力竭游泳造模,連續(xù)14 d,力竭標準為全組50%大鼠出現(xiàn)自然沉降,達標后全組大鼠停止游泳,同時高脂飼養(yǎng)。14 d后,大鼠毛色發(fā)黃,毛發(fā)粗糙,體型瘦弱,情緒暴躁,大便松散不成型;無創(chuàng)血壓儀測量大鼠收縮壓(systolic pressure,SBP)、平均動脈壓(mean blood pressure,MBP)和舒張壓(diastolic pressure,DBP)均不同程度地下降。大鼠由于長時間游泳體力消耗,腦組織處于嚴重缺氧狀態(tài),長久致氣虛;因處于冷水環(huán)境中,血液遇寒則凝,致血瘀;氣行血,氣虛無力推動血液運行致血瘀。
腹腔注射0.5%OVA Al(OH)3混懸液誘導過敏,2 d/次,共14 d;空白組給予Al(OH)330 mg+生理鹽水1 ml混懸液,2 d/次,共7次。全身抗原攻擊完成后,滴鼻給予0.6%OVA生理鹽水,每只每側(cè)50 μl,1 d/次,共7次??瞻捉M給予等量生理鹽水。30 min內(nèi)觀察大鼠是否出現(xiàn)搔鼻、噴嚏、鼻溢液及覓食等行為。造模完成后觀察大鼠有無懶動、脫毛、易驚、便溏、舌底紫暗、眼球暗紅等氣虛血瘀癥狀及撓鼻、打噴嚏、流涕等AR癥狀,空白組和模型組各取5只大鼠抽血檢測血液流變學指標。根據(jù)鼻部癥狀評分標準對鼻炎癥狀進行評分:鼻癢,輕擦鼻,記1分;到處摩擦,抓撓鼻、面部不止,記2分;噴嚏1~3個記1分,4~10個記2分,11個以上記3分;鼻涕流至前鼻孔記1分,超過前鼻孔記2分,流涕滿面記3分[5]。通過舌色和舌底靜脈長度觀察舌狀態(tài)。無紫暗,舌底色微青、舌靜脈主干長度不超過3/4,記0分;輕度紫暗,舌底色紫暗或舌靜脈主干長度超過3/4,記1分;明顯紫暗,舌底色紫暗且舌靜脈主干長度超過3/4,記2分[6]。便溏亦為氣虛血瘀證常見癥狀。對大鼠便溏狀況擬定的評分標準如下:大便成形,糞質(zhì)柔軟,記0分;輕度異常,糞便稀溏部分不成形,記1分;明顯異常,糞便稀溏完全不成形,記2分??偡侄嘤?分為造模成功。大鼠分為空白對照組、模型組、中藥低量組、中劑量組、高劑量組和西藥組。
1.2.2給藥方法 滴鼻給予各中藥組大鼠我院自制克敏芪丹鼻噴劑(0.010 8、0.021 6、0.043 2 g/ml),主要含黃芪、川芎等藥物,每側(cè)鼻孔滴注1次。西藥組滴鼻給予內(nèi)舒拿鼻噴劑5 μl,每側(cè)鼻孔滴注1次,連續(xù)給藥14 d??瞻捉M正常攝食飲水,模型組給予高脂飼料,并為正常飲食量的1/3,不限水,直至造模結(jié)束。
1.2.3標本采集 于末次給藥后24 h取全血5 ml,3 000 r/min離心15 min,置于潔凈干燥玻璃試管中密封,-20℃保存。組織標本制定:去除大鼠下頜骨上頜骨外周皮膚及周圍軟組織,沿鼻中隔軟骨和骨交界處以冠狀面切開部分鼻軟組織,鼻背正中切開,取出鼻中隔及鼻腔外側(cè)壁呼吸區(qū)黏膜組織,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)切片并進行HE染色。
1.2.4指標檢測 觀察大鼠有無搔鼻、噴嚏、鼻溢液等AR典型癥狀。HE染色后在顯微鏡下觀察大鼠鼻黏膜病理改變。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清IL-4、PAF含量,具體步驟參照試劑盒說明書進行。
1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗后,組間比較采用單因素方差分析。方差齊性采用LSD-t檢驗,方差不齊采用Tamhane′s T2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1大鼠血液流變學指標觀察 空白組和模型組各隨機取5只大鼠進行血液流變學檢測,見表1,與對照組相比,模型組大鼠低切、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)升高(P<0.05),中切及高切差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)合大鼠AR癥狀判定可繼續(xù)實驗,同時用藥階段仍進行游泳及OVA滴注以維持造模。
表1 大鼠血液流變學指標Tab.1 Serum rheological parameters of
2.2大鼠行為及體征觀察 各組治療前與空白對照組評分差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);給藥7 d后,中藥各劑量組和西藥組大鼠評分均降低,除中藥低劑量組外均與給藥前差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);給藥14 d后,中藥各劑量組和西藥組大鼠評分繼續(xù)降低,與給藥7 d后評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各治療組給藥7、14 d評分均有不同程度改善,與對照組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中中藥高劑量組、西藥組改善最為顯著,與中藥低量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。
表2 給藥后第1、7、14天大鼠行為及體征評分分)Tab.2 Behavioral and physical signs scores of rats at 1,7 and 14 d after
2.3鼻黏膜病理學觀察 空白對照組大鼠鼻黏膜組織完整,黏膜上皮各層細胞排列較整齊,偶見脫落,固有層可見腺管和散在血管,間質(zhì)無水腫變性;模型組大鼠鼻黏膜上皮細胞變性壞死,嗜酸性粒細胞浸潤,AR氣虛血瘀證中藥高量組大鼠鼻黏膜上皮部分完整,纖毛柱狀上皮排列較整齊,固有層結(jié)構(gòu)較清晰,中、低劑量組固有層內(nèi)可見少量炎癥細胞浸潤,黏膜上皮細胞增生肥厚及變性、邊緣不清,低劑量組尤甚;西藥組可見少量淋巴細胞、中性粒細胞或嗜酸性粒細胞散在分布于固有層或黏膜上皮,結(jié)構(gòu)基本完整。見圖1。
圖1 各組大鼠鼻黏膜病理切片HE染色圖(×400)Fig.1 HE staining figure of pathological sections of nasal mucosa of rats in each group(×400)
2.4大鼠血清IL-4、PAF表達比較 如表3所示,造模后模型組大鼠血清IL-4、PAF水平明顯上升,與空白組大鼠相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);用藥14 d后,中藥各劑量組、西藥組大鼠血清IL-4指標水平較模型組下降,其中中藥高劑量組、西藥組與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);各治療組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各治療組PAF水平均有所下降,但僅有中藥高劑量組PAF既與模型組有統(tǒng)計學意義(P<0.05),又與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
表3 各組大鼠血清IL-4、PAF水平Tab.3 IL-4 and PAF levels of rats of each
IL是一組由多種細胞分泌的、結(jié)構(gòu)和功能各異的可溶性蛋白,具有調(diào)節(jié)細胞生長、分化及免疫活性等作用[7]。AR是發(fā)生于鼻黏膜的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),是以IgE為主導、多種細胞因子和免疫細胞參與的非特異性炎癥反應(yīng)[8]。IL-4主要由活化的Th2細胞分泌,是IgE的特異性誘導劑[9]。IgE與變應(yīng)原結(jié)合產(chǎn)生以Th2細胞免疫為主導的病理改變,導致鼻黏膜血管擴張、清水樣鼻腔分泌物增多,黏膜蒼白水腫[10]。IL-4作用于膽堿能神經(jīng)導致腺體分泌旺盛、清水樣鼻腔分泌物,作用于感覺神經(jīng)導致鼻癢、打噴嚏等相關(guān)AR癥狀[11]。提示IL-4含量與鼻黏膜炎癥程度及機體過敏狀態(tài)相關(guān)。血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)可引起血管通透性增加,滲出增多,促進炎癥物質(zhì)釋放,還可誘導血小板聚集,是AR發(fā)病的另一重要炎癥介質(zhì)。正常情況下,PAF在體內(nèi)含量較低[12,13]。AR患者由于長期變應(yīng)原刺激,不但使PAF濃度升高,還會使其活性增強[14]。
克敏芪丹鼻噴劑由黃芪、防風、川芎等組成,補益脾肺,扶正氣,固護衛(wèi)表,黃芪味甘、溫,歸肺、脾經(jīng),具有補氣固表之效;川芎辛、溫,入心包經(jīng),有活血化瘀,兼行氣之能,被譽為“血中氣藥”,其合用有“補氣而不閉邪,活血而不傷正氣”之特點,共奏益氣活血通竅之功效。AR氣虛血瘀證患者鼻腔內(nèi)黏膜水腫,分泌物增多,使鼻腔內(nèi)組織處于持續(xù)炎癥浸潤,導致血管通透性增高,加重局部癥狀[15]。采用益氣活血鼻噴劑直接作用于上皮細胞被破壞的鼻黏膜(靶器官),可緩解鼻內(nèi)缺血缺氧癥狀,使毛細血管通透性降低,炎癥介質(zhì)、IL-4減少,血液循環(huán)通暢,氣滯血瘀癥狀減輕。
相關(guān)研究表明,黃芪可改善機體局部炎癥反應(yīng),減輕致敏狀態(tài),阻止炎癥介質(zhì)釋放,降低血清IL-4含量,可能與黃芪有效成分對免疫功能的雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)[16]。黃芪多糖為黃芪的主要成分,可促進免疫細胞如T細胞分化成熟,保護心肌及抗氧化,進而起抗炎作用。黃芪多糖在體外還能明顯抑制 ADP 誘導的兔血小板聚集,300 mg/L時抑制作用最強,原因可能為通過抑制血小板聚集,進而降低血清PAF含量[17]。
本研究發(fā)現(xiàn),克敏芪丹鼻噴劑和內(nèi)舒拿均可有效且持續(xù)地緩解AR的典型癥狀。HE染色結(jié)果說明,克敏芪丹鼻噴劑對AR引起的炎癥因子釋放、水腫、血管通透性下降等癥狀均有良好的緩解作用。2種藥物均能改善AR大鼠血清IL-4水平,差異無統(tǒng)計學意義,對單純性AR療效大致相同。經(jīng)克敏芪丹鼻噴劑治療后,PAF水平相較于模型組有所下降,更接近空白組,而西藥組則沒有這個效果。說明對PAF水平的改善克敏芪丹鼻噴劑優(yōu)于內(nèi)舒拿,由于其兼有益氣活血作用,對氣虛血瘀證AR的治療優(yōu)于內(nèi)舒拿。
由于造模周期短、強度不夠、抽取樣本量較少等原因,血液流變學指標中切、高切未表現(xiàn)出明顯差異,但由于用藥階段維持造模,血液流變學其他指標差異具有統(tǒng)計學意義,行為學及體征評分統(tǒng)計有顯著統(tǒng)計學差異,可認為造模成功,模型組PAF水平與空白組具有顯著差異也可說明這一點。
克敏芪丹鼻噴劑作為田理教授結(jié)合臨床用藥治療AR的純中藥鼻噴劑,目前對其研究及推廣還比較少。本研究通過與內(nèi)舒拿鼻噴劑進行比較,發(fā)現(xiàn)克敏芪丹鼻噴劑對AR具有良好的療效,對氣虛血瘀證AR效果更佳。臨床證據(jù)顯示,克敏芪丹鼻噴劑治療人體氣虛血瘀證AR的療效與內(nèi)舒拿療效相當,但克敏芪丹鼻噴霧劑在緩解氣虛血瘀癥狀方面優(yōu)于內(nèi)舒拿,推測可能與中藥作用于整個機體有關(guān)[3]。