周建利，王朝霞，周少明，張 巧，亁 霞

深圳市兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 深圳 518026

嬰兒膽汁淤積是由各種原因引起毛細膽管膽汁形成、分泌和/或膽汁排泄異常，使血中膽紅素升高，以直接膽紅素增高為主[1]。其病因較多，主要包括肝內(nèi)膽汁淤積和肝外膽汁淤積，而后者主要以膽道閉鎖最多見，國外流行病學資料[2]顯示，活產(chǎn)嬰兒中肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生率為1/2500，歐美國家膽道閉鎖發(fā)病率為1/9600～1/15 000，我國目前缺乏相關(guān)流行病學資料。

膽汁分泌系統(tǒng)作為連接肝臟和腸道的重要橋梁，在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和肝臟功能中起到非常重要作用[3]。膽汁可以維持腸道菌群功能穩(wěn)定和保持腸道菌群組成平衡[4-5]。目前，腸道菌群和肝臟疾病的關(guān)系是研究熱點，如以鳥槍法測序檢測成人肝硬化患者的腸道菌群與正常對照具有明顯差異[6]。基于前期雙胞胎腸道菌群研究經(jīng)驗[7]，本研究采用鳥槍法測序檢測42例膽汁淤積患兒及32例正常對照嬰兒的腸道菌群，在腸道菌群及功能方面進行研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2014年9月—2016年2月本院收治的42例膽汁淤積嬰兒的病例資料，定義為膽汁淤積組。納入標準：(1)年齡<1歲;(2)均符合膽汁淤積的診斷標準[1]。TBil<85.5 μmol/L，DBil>17.1 μmol/L或TBil≥85.5 μmol/L，DBil占TBil的比例>20%；(3)1周內(nèi)均未服用抗生素或微生態(tài)制劑。對照組選取兒童保健科體檢的正常嬰兒32例，納入標準：對照組嬰兒均經(jīng)兒保科體檢正常、年齡<1歲、排除膽汁淤積等疾病、1周內(nèi)均未服用抗生素或微生態(tài)制劑。

1.2 臨床資料收集 收集膽汁淤積組患兒性別、年齡、是否足月、生產(chǎn)方式、喂養(yǎng)方式、膽紅素水平及最終診斷等臨床資料。

1.3 標本收集 膽汁淤積組患兒統(tǒng)一在入院2 d內(nèi)完成大便標本收集，對照組嬰兒標本在符合入組標準下盡早收集，留取大便標本20 g，置于-80 ℃冰箱儲藏。

1.4 鳥槍法宏基因組學測序 標本收集完畢后進行DNA提取，采用鳥槍法宏基因組學測序，每個標本輸出2G原始數(shù)據(jù)，主要是門綱目科屬種各個分類上各個樣本的腸道菌群基因組成及比例。

1.5 腸道菌群分類和功能分析 得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉一些質(zhì)量低劣的序列后，每個樣品剩余的序列采用MEGAN5[8]進行分類和功能分析。使用VEGAN[9]對樣本多樣性進行分析，樣品多樣性是根據(jù)Jaccard指數(shù)計算，Jaccard指數(shù)(樣本A，樣本B)=(樣本A∩樣本B)/(樣本A∪樣本B)[7]，主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)采用VEGAN的多樣性功能。高豐度菌群定義為相對總數(shù)超過80%的菌群(超過90%的為門水平)。結(jié)果應(yīng)用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[10]和eggNOG數(shù)據(jù)庫[11]進一步功能注釋。

1.6 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2016020，所有納入嬰兒家屬均簽署知情同意書。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用M(P25～P75)表示，2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。得到的菌種和基因功能通路等數(shù)據(jù)用Shannon系數(shù)、Wilcoxon秩和檢驗和DESeq2[12]進行計算分析，利用Cytoscape[13]將2組的豐富菌種和相關(guān)聯(lián)系直觀表現(xiàn)出來。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 膽汁淤積組共42例，對照組共32例。2組間性別、就診年齡比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 2組患兒一般資料比較

2.2 腸道菌群多樣性比較 膽汁淤積組和對照組腸道菌群的組成在門水平有顯著差異(Z=0.000 046,P<0.05)(圖1a)，同時在功能水平上有顯著差異(Z=0.019 8,P<0.05)(圖1b)；2組腸道菌群在種水平上亦有差異(Z=0.000 014,P<0.05)(圖1c、d)。

注：a,門水平上基于Shannon系數(shù)計算2組樣品菌的豐度分布圖;b,KEGG注釋后基于Shannon系數(shù)計算2組樣品菌的功能分布圖;c,種水平上基于Jaccard指數(shù)計算2組對比圖，黑色為膽汁淤積組，紅色為對照組，可見膽汁淤積組聯(lián)系更緊密;d,種水平上基于主成分分析按照Rade4軟件包描繪的圖，膽汁淤積組(黑色)和對照組(紅色)可以被分開，提示兩組間有顯著差異。

2.3 高豐度菌群和功能通路比較 在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門在膽汁淤積組中顯著增加(圖2a)。在功能通路上，兩組比較具有顯著差異(Z=0.019 8,P<0.05)，如氨基酸代謝、糖代謝和其他通路(圖2b)，提示膽汁淤積組氨基酸代謝、糖代謝和膜運輸通路都明顯減弱。

注：a,門水平上排名靠前的菌，縱坐標為所占比例；b，排名靠前的功能通路，縱坐標為所占比例。

潛在致病菌如農(nóng)研絲桿菌GR20-10(NiastellakoreensisGR20-10)和韋永氏球菌DSM 2008(VeillonellaparvulaDSM 2008)、加氏乳桿菌ATCC33323(LactobacillusgasseriATCC 33323)和沼洋紅假單胞菌BisB18(Rho-dopseudomonaspalustrisBisB18)在膽汁淤積組中極為豐富;雙歧桿菌(Bifidobacterium)如長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、齒雙歧桿菌Bd1(BifidobacteriumdentiumBd1)和短雙歧桿菌ACS-071-V-Sch8b(BifidobacteriumbreveACS-071-V-Sch8b)在對照組極為豐富,狄氏副擬桿菌ATCC 8503(ParabacteroidesdistasonisATCC 8503)在對照組中也較豐富，但在膽汁淤積組中明顯減少(圖3)。

注：由Cytoscape展示的交互網(wǎng)絡(luò)圖，農(nóng)研絲桿菌GR20-10(Niastella koreensis GR20-10)、韋永氏球菌DSM 2008(Veillonella parvula DSM 2008)、加氏乳桿菌ATCC33323(Lactobacillus gasseri ATCC 33323)和沼澤紅假單胞菌BisB18(Rhodopseudomonas palustris BisB18)在膽汁淤積組中極為豐富。雙歧桿菌(Bifidobacterium)如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、齒雙歧桿菌Bd1(Bifidobacterium dentium Bd1)和短雙歧桿菌ACS-071-V-Sch8b(Bifidobacterium breve ACS-071-V-Sch8b)在對照組中極為豐富，狄氏副擬桿菌ATCC 8503(Parabacteroides distasonis ATCC 8503)在對照組中也是較豐富的。

3 討論

膽汁淤積是嬰兒常見疾病，以皮膚、鞏膜黃染為主要表現(xiàn)，實驗室指標提示膽紅素升高，以DBil升高為主，病因多種多樣，部分病因尚不清楚，本研究膽汁淤積組以病因未明組居多，膽道閉鎖次之，考慮病例數(shù)較少，無法根據(jù)不同病因進行對照研究，故僅研究膽汁淤積嬰兒對腸道菌群的影響。文獻[14]報道,膽汁淤積對腸道菌群的作用機制主要是由于腸道膽汁酸缺乏導致菌群失調(diào)，腸道黏膜的機械、化學、免疫及生物屏障均被破壞，細菌代謝產(chǎn)物及內(nèi)毒素入血，引起器官和組織損傷。腸腔內(nèi)膽汁分泌減少似乎對腸道微生物調(diào)節(jié)起著重要作用，這反過來可能影響疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究中，與健康對照相比，膽汁淤積組患者的腸道菌群組成的多樣性更顯著，膽汁淤積組樣本中腸道微生物群組成波動更加劇烈，細菌豐富度增加。研究[15]發(fā)現(xiàn)，膽汁流量減少有利于腸道細菌的生長，特別是那些致病和促炎菌。在生命的最初幾個月，作為腸道微生物群定植的關(guān)鍵階段，微生物群組成在腸道內(nèi)的動態(tài)變化易受腸道環(huán)境變化的影響[16-18]。膽汁淤積通常發(fā)生在出生后1個月內(nèi)，對干預(yù)嬰兒腸道微生物群的發(fā)展產(chǎn)生影響。盡管患者病程相對較短(平均年齡2.7個月)，但他們的腸道微生物群已經(jīng)顯示出過度生長的趨勢。本研究結(jié)果證實，膽汁淤積是改變這些患者腸道微生物群落的一個重要因素。在這個早期脆弱階段，腸道微生物群結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化可能與長期健康問題有關(guān)，如黏膜免疫發(fā)育[19]。然而，據(jù)報道[20]，在成人肝硬化中觀察到腸道微生物多樣性降低。由于正在生長的嬰兒的腸道微生物群仍處于分化和成熟期，因此在膽汁淤積嬰兒中保持微生物群體多樣性是合理的。盡管膽汁淤積組患者的組成多樣性高于對照組，但膽汁淤積組患者腸道微生物群的功能多樣性較低。也就是說，組成多樣化的腸道微生物群并沒有相應(yīng)地導致微生物群功能多樣化，暗示了微生態(tài)失調(diào)。

為了研究膽汁淤積組患者腸道微生物群的特征，檢測不同分類水平的詳細組成變化。一般資料顯示兩組中性別、年齡有差異，但是研究[21]表明不同性別、不同月齡嬰兒腸道菌群在門水平上無明顯差異，故對研究結(jié)果無明顯影響，本研究發(fā)現(xiàn)膽汁淤積組患者的擬桿菌門和厚壁菌門顯著增加。擬桿菌門的增加可能導致農(nóng)研絲桿菌GR20-10的增加。膽汁淤積組患者中雙歧桿菌明顯減低，而農(nóng)研絲桿菌GR20-10和韋永氏球菌則更為豐富。嬰兒期微生物組研究[22]表明，雙歧桿菌、乳酸桿菌和韋永氏球菌屬于4月齡嬰兒腸道微生物組的特征性菌群組成。因此，生命的前4個月是這些物種生長的關(guān)鍵時期，它們對環(huán)境變化也更敏感。由于兩組中的大部分樣本都是在4個月前收集的，因此應(yīng)考慮此階段腸道微生物組的發(fā)育特征。在此期間，由于膽汁分泌減少和腸道雙歧桿菌減少，韋永氏球菌和農(nóng)研絲桿菌很可能瘋狂成長。農(nóng)研絲桿菌在膽汁淤積組患者的腸道菌群中顯著增加。作為擬桿菌門中的新物種，農(nóng)研絲桿菌尚未報道與何種人類疾病相關(guān)，目前尚不清楚它們是否與嬰兒膽汁淤積有關(guān)，或者只是在不穩(wěn)定的嬰兒腸道菌群發(fā)育期間發(fā)生暫時轉(zhuǎn)變。研究[6,15,20,23]發(fā)現(xiàn),韋永氏球菌在成人肝硬化中也過度生長。已知韋永氏球菌是口腔起源并富集在小腸中，其富集反映了口腔細菌對腸道的侵入增加和小腸細菌過度生長和易位，這與人類肝硬化的內(nèi)毒素血癥有關(guān)[24-25]。膽汁淤積組中長雙歧桿菌、齒雙歧桿菌Bd1和短雙歧桿菌ACS-071-V-Sch8b等有益菌較對照組明顯減少，這與近年的研究相符[26]，因此，增加雙歧桿菌等有益菌攝入可能減少韋永氏球菌、農(nóng)研絲桿菌和沼澤紅假單胞菌BisB18等潛在致病菌的生長，從而改善疾病的發(fā)展。

隨著腸道微生物組成的改變，膽汁淤積組患者的腸道微生物功能也出現(xiàn)了明顯變化?；贙EGG數(shù)據(jù)庫分析，膽汁淤積組患者的腸道微生物功能明顯減弱，尤其是氨基酸代謝，碳水化合物代謝和膜轉(zhuǎn)運；同時，膽汁淤積組患者的未分類功能(無法分類或功能不明)顯著升高，然而，腸道微生物群功能并沒有與腸道細菌組成的多樣性處于同一水平線上。目前尚不清楚這些未分類的功能是否會發(fā)展為特征性功能或仍然是未知數(shù)。膽汁淤積組患者的微生物功能的這種組內(nèi)變異可能歸因于那些大量未分類的功能，除了未分類的功能外，膽汁淤積組患者中與膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的標志物，與肝硬化、IBD、肥胖和2型糖尿病一致[6,27-29]。膽汁淤積組患兒腸道菌群那些大量未分類的功能有待進一步深入研究。

本研究顯示,膽汁淤積患兒的腸道菌群在結(jié)構(gòu)及功能上發(fā)生改變，腸道菌群差異主要表現(xiàn)在潛在致病菌的生長和菌群缺乏某些功能。膽汁淤積患兒中有益菌如雙歧桿菌明顯減少，而潛在致病菌如韋永氏球菌和農(nóng)研絲桿菌明顯增多，有可能導致膽汁流動減少。發(fā)現(xiàn)膽汁淤積患兒腸道菌群的功能明顯減弱，如氨基酸代謝、糖代謝等，同時一些未分類功能增強，可能與膽汁淤積相關(guān)。本研究展示了膽汁淤積患兒在疾病期的腸道菌群組成和功能特點，為進一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

本研究具有一定局限性，包括樣本量偏小，膽汁淤積病因較多，不同病因嬰兒的腸道菌群可能有不一樣的變化，一般資料中性別和年齡沒有嚴格限制。在未來研究中可以加大樣本量，在不同病因的膽汁淤積患兒中進行對照研究，嚴格設(shè)置入組標準，減少對結(jié)果的影響，希望未來有更好的研究成果。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：周建利、王朝霞、周少明等負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；張巧、亁霞等參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；王朝霞、周少明等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。