吳 橋，余朋飛，畢研貞，王寶增，王子璇，李志杰，陳 煜，段鐘平

1 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 a.疑難肝病及人工肝中心, b.肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室，北京100069； 2 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院 感染中心，北京 100070； 3 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心肝膽外科中心，北京 100039

對乙酰氨基酚(N-乙?；?對氨基苯酚，APAP)是用于鎮(zhèn)痛和解熱的常用藥物,但過量服用時有很高的毒性，并可以導致急性肝衰竭[1-2]。在歐美國家，高劑量的APAP是藥物引起肝損傷的主要原因[3]。在中國，APAP誘發(fā)了約0.40%的藥物性肝損傷[4]。目前臨床治療藥物有限，其特效藥乙酰半胱氨酸治療窗狹窄，迫切需要尋找安全有效的治療藥物。APAP在體內(nèi)的代謝涉及肝臟Ⅰ相和Ⅱ相酶相關(guān)解毒途徑。在肝Ⅱ相結(jié)合酶[包括UDP-葡糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)和磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferases，SULT)]的作用下大約85%的APAP被處理為APAP-gluc和APAP-sulfur，并通過尿液排出[4-5]。 目前廣泛認為APAP的毒性產(chǎn)物N-乙酰基-對苯醌亞胺(N-Acetyl-p-benzo-quinoneimine，NAPQI)主要是通過肝 Ⅰ 相反應通過細胞色素P450(CYP)途徑(主要是通過CYP2E1/CYP1A2)產(chǎn)生的[4]。在APAP過量的情況下，Ⅱ相反應變得飽和，但NAPQI的過量產(chǎn)生會耗盡肝谷胱甘肽(GSH)并修飾細胞蛋白。這破壞了氧化還原平衡，造成了線粒體損傷，從而導致氧化應激引起的肝損傷[6]。

肝爽顆粒是臨床上常見的保肝藥物，主要功能為舒肝健脾、清熱散瘀、保肝護肝、軟堅散結(jié)，用于急慢性肝炎、肝硬化、肝損傷。有前期研究[7-8]表明，肝爽顆粒對慢性肝損傷患者具有保護性作用，但其具體機制仍不清楚。目前，氧化應激和線粒體功能障礙被認為是APAP肝細胞毒性的主要細胞過程，因此，抑制氧化應激和改善線粒體功能在減輕APAP誘導的急性肝損傷中具有重要作用[9]。肝爽顆粒及其主要有效成分(柚皮苷)可以抗氧化及降低CYP2E1表達的作用[10-11]，據(jù)此筆者推測肝爽顆?？梢杂行Ц纳艫PAP引起的肝損傷。為此建立了體外APAP損傷的細胞模型(HepG2細胞)，驗證肝爽顆粒的細胞保護作用及抗氧化作用，檢測氧化應激相關(guān)指標[GSH、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)]，觀察肝爽顆粒對APAP代謝相關(guān)的Ⅰ相酶(CYP2E1/1A2)和Ⅱ相酶(UGT1A1/1A3/1A6/2B7、GSTα1/m1、SULT1A1/2A1)的影響，探討其對線粒體功能[線粒體膜電位、上清谷氨酸脫氫酶(GDH)]的影響，并進一步對機制進行研究，從而為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 胎牛血清(SH30406，Hyclone)，APAP(HY-66005，MCE)，0.25%EDTA-trypsin(25200056，Gibco)，肝爽顆粒浸膏(山東步長制藥股份有限公司)，RIPA裂解液(R0010，Solarbio)、TRIzol試劑(15596018)、Image-iTTMTMRM Reagent (mitochondrial membrane potential indicator)(I34361)、Hoechst 33342(H3570)購自Invitrogen，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)(TakaRa，大連，中國)、實時熒光定量(RT-PCR)儀器(Stepone plus，Applied Biosystems)，MDA測定試劑盒(TBA法)(A003-1)、ROS測定試劑盒(化學熒光法)(E004)、SOD測定試劑盒(WST-1 法)(A001-3)、GSH測定試劑盒(微板法)(A006-2)、GLDH/GDH測試盒(紫外比色法)(A125)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗分組設置 本實驗設置5組細胞培養(yǎng)組，分別為正常對照組、APAP損傷組、3組不同肝爽顆粒浸膏濃度的損傷保護組。使用20 mmol/L APAP加入細胞培養(yǎng)液孵育24 h構(gòu)建造體外藥物肝損傷模型，損傷保護組提前加用不同濃度肝爽顆粒浸膏(0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml)8 h孵育后加入APAP損傷24 h。

1.3 HepG2細胞培養(yǎng) HepG2細胞由本實驗室保存，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，濕度為95%，5% CO2細胞培養(yǎng)箱(購自美國 Thermo Forma公司)中培養(yǎng)。細胞貼壁85%～90%時用 EDTA-胰酶消化，細胞活率在90%以上進行1∶4傳代培養(yǎng)。

1.4 體外細胞模型的建立 將HepG2 細胞以2×106/ml接種到6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)24 h細胞全部貼壁后，分別設對照組、損傷組(20 mmol/L APAP)和3組損傷保護組，提前8 h分別換液加入：正常培養(yǎng)基、正常培養(yǎng)基、0.2 μg/ml肝爽浸膏、1 μg/ml肝爽浸膏、5μg/ml肝爽浸膏對損傷保護組進行預保護，隨后換液加入：正常培養(yǎng)基(對照組)、20 mmol/L APAP(損傷組及損傷保護組)進行干預處理。

1.5 MTT實驗 將 HepG2 細胞以1×104/ml接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，細胞全部貼壁后，按1.3步驟進行造模后，加入MTT工作液，用多功能酶標儀在490 nm處檢測細胞的存活率，每個濃度設3個重復孔，實驗重復3遍。

1.6 GSH、SOD、MDA、ROS檢測 將細胞按1.3步驟干預后，棄上清，用PBS清洗1～2遍后，使用RIPA裂解液將細胞裂解下來，取上清，按檢測方法參照說明書進行相關(guān)實驗步驟處理，用多功能酶標儀檢測細胞中MDA含量及 GSH、SOD、GDH活性。

1.7 高內(nèi)涵檢測線粒體膜電位 將細胞按1.3步驟干預后，棄上清，用HBSS清洗1～2遍后，將線粒體膜電位染料(Image-iT-TM TMRM Reagent)1∶1000加入HBSS，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min 37 ℃，HBSS洗3遍，加普通培養(yǎng)基，后拍照，3 h后繼續(xù)拍照。

1.8 RT-PCR及Western Blot檢測 RT-PCR：收集上述各組細胞，使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA。使用隨機引物和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)由1 μg RNA合成cDNA。使用ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)進行SYBR Green實時逆轉(zhuǎn)錄PCR。引物由上海生工公司合成(表1)。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算靶基因的相對表達。

表1 引物序列

Western Blot檢測:收集上述各組細胞，提取細胞總蛋白，以BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，每個樣品取34 μg蛋白，采用30%丙稀酰胺-甲叉雙丙稀酰胺凝膠電泳。用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。用5%BSA-TBST稀釋一單克隆抗體4 ℃搖動孵育過夜。次日洗滌后孵育第二抗體，室溫搖動40 min，再用TBST洗脫3遍后發(fā)光液進行化學顯色并拍照。

2 結(jié)果

2.1 肝爽顆粒浸膏對APAP引起的肝細胞毒性的影響 APAP組細胞活力明顯下降，經(jīng)肝爽顆粒浸膏預處理后，細胞活力得到改善，尤其1 μg/ml及5 μg/ml兩組與APAP組比較有明顯統(tǒng)計學差異(P值均<0.05)。加入APAP后細胞培養(yǎng)上清中的AST、ALT、LDH含量顯著上升，而肝爽顆粒浸膏的預處理組明顯下降，提示肝爽顆粒體外可以保護APAP引起的肝細胞損傷(P<0.05)(表2)。

表2 肝爽浸膏對APAP誘導的HepG2細胞急性損傷的影響

2.2 肝爽顆粒浸膏對APAP誘導的肝臟氧化應激指標的影響 與對照組相比，加入APAP導致細胞內(nèi)MDA、ROS水平顯著增加，GSH水平降低(P值均<0.05)，表明APAP引起了肝細胞的氧化應激反應。APAP還將SOD活性水平降低了20%。肝爽顆粒浸膏預處理以劑量依賴性方式顯著阻止了APAP的所有作用(表3)。

表3 肝爽浸膏對APAP誘導的氧化應激指標的影響

2.3 肝爽顆粒浸膏對APAP誘導的肝細胞線粒體損傷的影響 圖1使用高內(nèi)涵熒光實時監(jiān)測APAP誘導的肝細胞線粒體膜電位變化，可見3 h對照組熒光強度隨著細胞的增殖強度變強，而APAP損傷造成熒光強度降低，肝爽顆粒浸膏預處理以劑量依賴性方式增強了線粒體膜電位，保護了線粒體膜的穩(wěn)定性。為了進一步驗證肝爽顆粒浸膏對線粒體損傷的保護作用，檢測了不同組別上清中GDH的含量，可見1 μg/ml及5 μg/ml肝爽顆粒浸膏處理組的GDH顯著下降(表4)。

表4 肝爽浸膏對APAP誘導的線粒體損傷的影響

2.4 肝爽顆粒浸膏對CYP2E1/1A2表達的影響 通過RT-PCR檢測CYP2E1/1A2 mRNA表達水平，觀察到單獨使用APAP可以提高CYP2E1/1A2 mRNA水平。而與此同時，1 μg/ml及5 μg/ml肝爽顆粒浸膏可以抑制CYP1A2表達，同時顯著抑制CYP2E1表達(表5)。

表5 肝爽浸膏對不同組別CYP2E1/1A2 mRNA表達水平的影響

2.5 肝爽顆粒浸膏對肝細胞Ⅱ相酶表達的影響 如圖2所示，Ⅱ相酶水平受最低劑量的肝爽顆粒浸膏影響。與對照組相比，單用APAP顯著下調(diào)了肝臟Ⅱ相酶的表達。同樣，肝爽顆粒浸膏以劑量依賴性方式使Ⅱ期酶的mRNA水平升高。 最終劑量為5 μg/ml的損傷保護組顯著選擇性地上調(diào)了Ⅱ期酶的靶基因，導致上調(diào)程度比對照組高785%、936%、1275%和725%分別為UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6和SULT2A1。

注：高內(nèi)涵監(jiān)測不同組別0、3 h后線粒體膜電位TRME強度。

注：與APAP組相比,*P<0.05，**P<0.001。

2.6 肝爽顆粒浸膏可以誘導Nrf2及其下游基因的表達

使用蛋白質(zhì)印跡法和實時熒光定量PCR檢測肝細胞系中Nrf2的表達。與對照組相比，在預處理組中，Nrf2的蛋白質(zhì)水平及mRNA水平顯示均展現(xiàn)出上升的趨勢(P值均<0.05)(圖3，表6)。 此外，與單獨的APAP組相比，1 μg/ml及5 μg/ml肝爽顆粒浸膏預處理組的GCLC及NQO-1(Nrf2的靶基因)mRNA水平的表達顯著增強(P值均<0.05)(表6)。

注：Western Blot檢測不同組別Nrf2蛋白水平表達結(jié)果。

3 討論

APAP誘導的肝損傷是發(fā)達國家急性肝衰竭的主要原因。由于現(xiàn)有的治療方法有限，因此迫切需要開發(fā)新的治療方法。氧化應激在APAP誘導的肝損傷中起到了至關(guān)重要的作用。在之前的文章報道中，肝爽顆粒已經(jīng)顯示出抗氧化的能力。根據(jù)現(xiàn)有研究，筆者以經(jīng)APAP處理的HepG2細胞為體外肝損傷模型進行肝爽顆粒保護作用研究。APAP可被CYP2E1/1A2酶代謝為NAPQI，其可以與GSH發(fā)生化學和酶結(jié)合，這可能導致脂質(zhì)過氧化、硝化蛋白和隨后的線粒體損傷[12]。已有研究[13-14]表明，APAP過量可降低抗氧化酶活性，一些藥物已被證實可以恢復酶的部分功能。在本研究中，APAP使肝細胞內(nèi)GSH、SOD濃度減少，MDA、ROS濃度升高，這些都是氧化應激的指標。肝爽顆粒浸膏預處理的細胞組較APAP組抗氧化酶水平升高，ROS、MDA濃度降低。這些數(shù)據(jù)表明，肝爽顆粒浸膏可以提高抗氧化酶水平，從而對APAP誘導的氧化應激反應起到了保護作用。APAP可導致肝臟中CYP2E1/1A2表達增加，肝爽顆粒浸膏可顯著抑制CYP2E1/1A2的表達，減少了毒性代謝產(chǎn)物NAPQI的產(chǎn)生，同時也提高抗氧化酶的水平，這可能就是肝爽顆粒具有較強的抗氧化作用的原因。UGT、SULT和GST等 Ⅱ 相酶的催化代謝對于APAP無毒代謝有著重要作用，APAP在肝臟中經(jīng)歷 Ⅱ 期解毒途徑，約85%的APAP被包括UGT和SULT在內(nèi)的 Ⅱ 相肝酶以APAP-gluc和APAP-sulf的形式處理代謝掉[15]。在本研究中，有7種Ⅱ相酶(UGT1A1/1A3/1A6、SULT1A1/2A1、GSTα1/m1)參與了APAP的解毒，它們是UGT、SULT和GST的主要酶和主要亞型。本研究明確了大部分Ⅱ期酶mRNA的表達由肝爽顆粒浸膏調(diào)節(jié)呈劑量依賴性增加。同時，肝爽顆粒浸膏顯著提高了UGT1A9和SULT2A1的mRNA水平。本研究結(jié)果表明，Ⅱ相酶的調(diào)節(jié)可能參與了肝爽顆粒浸膏保護肝細胞損傷的機制。線粒體功能障礙在APAP誘導的肝細胞毒性中起重要作用，最小化線粒體損傷和/或增強線粒體功能的治療可以提高APAP誘導的肝損傷中的肝細胞存活率和治療結(jié)果[9]。不同濃度的肝爽顆粒浸膏預處理組的線粒體膜電位得到了不同程度的恢復，線粒體損傷指標GDH呈現(xiàn)劑量依賴性下降。

Nrf2激活是誘導Ⅱ相酶表達的關(guān)鍵。Nrf2的重要性是非常明確的，有報道[16-17]顯示，在Nrf2缺陷小鼠中，Ⅱ相酶基因水平顯著降低。本研究結(jié)果顯示，肝爽顆粒浸膏顯著增加了SULT和UGT的水平。此外，有報道[18]表明，Nrf2缺失小鼠對APAP誘導的肝損傷表現(xiàn)出更高的易感性，這表明Nrf2是肝保護的一個靶點。Nrf2是一種CNC-bZIP蛋白，被認為是氧化防御的主要調(diào)節(jié)因子。肝爽顆粒浸膏預處理誘導肝細胞組Nrf2蛋白水平和mRNA水平表達均有不同程度上調(diào)。有學者[19]發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)HepG2細胞的Nrf2來激活GCLC，GCLC是谷胱甘肽(細胞中主要的抗氧化劑分子)合成中的主要限速酶[20]。肝爽顆粒浸膏可增加Nrf2下游基因GCLC及NQO-1的mRNA水平的表達，導致GSH水平升高。上述結(jié)果表明，Nrf2參與了肝爽顆粒浸膏誘導的解毒和抗氧化信號通路。

表6 肝爽浸膏對Nrf2、GCLC及NQO-1 mRNA水平的影響

本研究認為肝爽顆粒浸膏可通過兩種途徑預防APAP誘導的肝細胞損傷，第一種途徑是肝爽顆粒浸膏下調(diào)CYP2E1/1A2的表達，從而降低了APAP產(chǎn)生的有毒物質(zhì)NAPQI濃度；第二種途徑是肝爽顆粒浸膏上調(diào)解毒通路的表達,它能激活Nrf2增加抗氧化酶(SOD、GSH)和Ⅱ相酶的表達，從而加速APAP的無害代謝。綜上所述，肝爽顆粒浸膏作為一種天然藥物的復合物，對APAP的解毒有著有益的影響，并通過Nrf2的激活，與CYP2E1活性的抑制以及抗氧化酶和Ⅱ期酶的上調(diào)有關(guān)。總之，肝爽顆粒是一種有希望用于治療APAP引起的肝損傷藥物。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：吳橋負責課題設計，資料分析，撰寫論文；余朋飛負責細胞實驗、指標檢測；畢研貞負責高內(nèi)涵檢測及ROS數(shù)據(jù)的采集；王寶增、王子璇、李志杰參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；陳煜、段鐘平負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。