易小康，杜毅超，錢保林，黃治偉，李 秋，付文廣，溫 劍

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 a. 四川省院士(專家)工作站； b. 普通外科(肝膽方向)，四川 瀘州 646000

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)是肝移植和肝切除術(shù)不可避免的臨床問題[1]。HIRI在臨床中能造成患者嚴重的肝功能障礙，甚至肝衰竭、多器官功能衰竭和死亡，其發(fā)生機制復(fù)雜，涉及自噬、炎癥激活、細胞凋亡、氧化應(yīng)激[2-4]等多個方面。目前HIRI尚無特異性藥物治療手段，探索HIRI新的治療藥物有重要的臨床意義。

丹參為中國傳統(tǒng)中草藥，在冠心病、腦卒中及閉塞性動脈炎等心腦血管疾病中已證實具有良好的治療效果[5-6]。丹參酮Ⅰ(tanshinone Ⅰ, T-Ⅰ)為丹參根部的主要的脂溶性有效成份之一，在多種疾病動物模型中均表現(xiàn)出良好的抗氧化應(yīng)激能力，如腦缺血再灌注損傷、帕金森氏病以及砷誘導(dǎo)的肺部炎癥等[7-10]。然而，尚無研究表明T-Ⅰ是否在HIRI中有保護作用。本研究通過建立HIRI小鼠模型，探討T-Ⅰ在HIRI中的保護作用，希望為HIRI這一臨床難題探索新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6J健康雄性小鼠36只，8～12 周齡，體質(zhì)量(22±2)g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京) 2015-0015，實驗動物使用許可證編號：SYXK(川) 2013-181。

1.2 主要試劑 T-Ⅰ(貨號: T118876)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，ALT、AST檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)與氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide, GSSG)檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、Caspase 3 活性檢測試劑盒、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)兔多克隆抗體、二抗均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Caspase-3兔多克隆抗體購自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理 將經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的36只C57BL/6J健康雄性小鼠隨機分成6組: 假手術(shù)(sham,n=6) 組、缺血再灌注(IR,n=6)組、IR+T-Ⅰ(5 mg/kg)組(n=6)、IR+T-Ⅰ(10 mg/kg)組(n=6)、IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組(n=6)和IR+T-Ⅰ(40 mg/kg)組(n=6)，各組均腹腔注射給藥，假手術(shù)組與模型組注射等量溶劑橄欖油，IR+T-Ⅰ組給藥1次/d，連續(xù)給藥7 d，末次給藥2 h后建立70% HIRI模型。

1.3.2 肝缺血再灌注動物模型構(gòu)建 術(shù)前12 h禁食，麻醉后消毒鋪巾，按照Gao等[11]的方法，取上腹正中切口，分離肝臟周圍韌帶，暴露第一肝門，無損傷血管夾鉗夾閉肝左、中門靜脈及肝動脈分支，構(gòu)建70%的缺血，阻斷后可見被相應(yīng)肝葉由鮮紅色變?yōu)樯n白色即表示肝缺血成功，60 min后松開血管鉗恢復(fù)血流，即行再灌注6 h。假手術(shù)組小鼠開腹后僅游離第一肝門，不阻斷血流。各組小鼠于再灌注6 h后眼球取血法收集血液，離心取上清液，-80 ℃保存。處死小鼠，取左、中葉肝組織用于后續(xù)實驗。

1.3.3 血清ALT、AST檢測 小鼠眼球取血，于1000 r/min 4℃離心10 min，取上層血清，使用ALT、AST測試盒，嚴格按照測試盒說明書步驟操作檢測ALT和AST。

1.3.4 肝組織中MDA、SOD、GSH和Caspase-3檢測 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，小鼠肝組織使用PBS勻漿后，12 000g離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度，檢測MDA水平；小鼠肝組織使用SOD樣品制備液在4 ℃勻漿后，12 000g4 ℃ 離心3 min，取上清作為待測樣品檢測SOD水平；小鼠肝組織使用新鮮配置的蛋白去除試劑M溶液在4 ℃勻漿，4 ℃放置10 min后，10 000g4 ℃ 離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度，檢測GSH水平；小鼠肝組織使用試劑盒提供的裂解液勻漿后，冰浴再裂解5 min，4 ℃ 16 000～20 000g離心10～15 min，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度，檢測Caspase-3水平。

1.3.5 組織學分析 將肝中葉在4%的多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察肝組織損傷情況。

1.3.6 免疫組化分析 將肝中葉于室溫下4%的多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片，經(jīng)石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉等步驟后，分別滴加HO-1(1∶100)或caspase-3(1∶100)抗體4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶100稀釋)覆蓋組織，室溫孵育50 min，加新鮮配制的DAB顯色液顯色完全后，復(fù)染細胞核、脫水封片，顯微鏡下觀察、拍照，棕褐色為陽性。

1.3.7 TUNEL法檢測肝細胞凋亡水平 將肝中葉室溫下4%的多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片，對石蠟切片進行脫蠟處理，嚴格按照說明書使用TUNEL試劑盒檢測肝組織凋亡。顯微鏡下觀察、拍照，棕褐色為陽性。

1.4 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批，批號：201906-50，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結(jié)果

2.1 T-Ⅰ降低小鼠肝臟缺血再灌注模型中ALT、AST水平 與sham組比校，IR組的血清ALT、AST水平顯著升高(P值均<0.01)；用不同濃度的T-Ⅰ預(yù)處理后，各組血清ALT、AST水平較IR組明顯下降(P值均<0.01)(表1)，且IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組的治療效果最佳，故20 mg/kg為IR模型中的最佳治療濃度。

表1 5組間ALT、AST水平的比較

2.2 T-Ⅰ減輕小鼠肝臟缺血再灌注模型肝組織病理損傷 HE結(jié)果顯示,sham組小鼠肝細胞形態(tài)正常，胞核居中大而圓，肝細胞無壞死及炎性細胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列齊整。IR組可見肝組織損傷嚴重，肝細胞灶性或大面積變性壞死，細胞核被擠向一邊，細胞間界限不清，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列不規(guī)則，表明HIRI模型成功。與IR組比較，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組的小鼠肝臟病變明顯緩解，肝組織炎癥浸潤輕微，細胞輪廓仍清晰可見，未見到大面積壞死灶，局部見肝細胞壞死，肝組織結(jié)構(gòu)基本完整(圖1)。

注：a，sham組；b，IR組；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組。

2.3 T-Ⅰ抑制小鼠HIRI模型肝組織凋亡 TUNEL結(jié)果顯示，Sham組無明顯凋亡肝細胞，與Sham組比較，IR組見大片凋亡肝細胞；與IR組比較，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組的小鼠凋亡肝細胞明顯減少(圖2)。免疫組化染色結(jié)果顯示，Sham組無明顯Caspase-3蛋白表達，與Sham組比較，IR組見大量Caspase-3蛋白表達。與IR組比較，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組的Caspase-3蛋白表達明顯減少(圖3)。相應(yīng)的，將肝組織勻漿后檢測Caspase-3活性，與sham組比較，IR組的Caspase 3 活性顯著升高(P<0.01)；與IR組比較，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組的Caspase 3 活性明顯下降(P<0.01)(表2)。

注：a，sham組；b，IR組；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組。

2.4 T-Ⅰ增強小鼠HIRI模型的肝臟抗氧化能力 與sham組比較，IR組小鼠肝組織中MDA的水平顯著升高，SOD活性及GSH水平顯著降低(P值均<0.01)；與IR組比較，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組的MDA水平顯著降低，SOD活性及GSH水平明顯升高(P值均<0.05)(表2)。免疫組化結(jié)果顯示，sham組小鼠肝組織中未見HO-1表達，而IR組可見HO-1蛋白表達；與 IR組比較，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組的HO-1表達明顯升高(圖4)。

表2 3組間MDA、SOD、GSH、Caspase-3水平的比較

注：a，sham組；b，IR組；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組。

注：a，sham組；b，IR組；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)組。

3 討論

HIRI是肝切除、肝移植術(shù)后肝功能障礙和肝衰竭的主要原因[12]，預(yù)防和治療HIRI已成為臨床研究重要的課題之一。目前認為，抗HIRI最有希望的方法是預(yù)處理和藥理學方法[13]。近年來，越來越多研究[14-16]發(fā)現(xiàn)中草藥在HIRI過程中的保護作用。T-Ⅰ為丹參根部的主要脂溶性有效成份之一，具有強力的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。既往多項研究[7-10,17]表明，T-Ⅰ在腎臟缺血再灌注小鼠模型、腦缺血再灌注小鼠模型、帕金森氏病小鼠模型、砷誘導(dǎo)的肺部炎癥等眾多小鼠模型中均可通過抗氧化活性發(fā)揮強大的治療作用。近期研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，丹參的另一脂溶性成分丹參酮ⅡA預(yù)處理后可減輕老鼠的HIRI損傷，然而，迄今為止，國內(nèi)外均無研究表明T-Ⅰ是否在HIRI中有保護作用。目前HIRI沒有確切有效的干預(yù)方法[20]，其發(fā)生機制復(fù)雜，涉及多方面因素，其中，再灌注產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致HIRI的主要機制[21]，因此，調(diào)控肝內(nèi)氧化應(yīng)激可能為HIRI的有效治療開辟新的途徑，故T-Ⅰ可能通過抗氧化活性對HIRI起到保護作用。為了明確這一假設(shè)，筆者首次將T-Ⅰ應(yīng)用在HIRI模型中，發(fā)現(xiàn)其對HIRI起到了確切有效的保護作用，證實其保護作用與抑制肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和肝細胞凋亡有關(guān)。

在某些情況下，氧化應(yīng)激的升高水平可以維持很長時間，這取決于氧化還原平衡的狀態(tài)，改變的氧化還原穩(wěn)態(tài)可能對細胞器官功能有不同的影響。GSH作為最豐富的非蛋白硫醇存在于所有哺乳動物組織中，是一種主要的抗氧化劑，它能清除多種活性氧物質(zhì)，抵御氧化應(yīng)激[22]。它直接作為自由基清除劑和谷胱甘肽過氧化物酶的底物，減少過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，還可與外源性物質(zhì)和/或其代謝物結(jié)合，并在解毒過程中發(fā)揮重要作用[23]。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，可清除超氧自由基，對氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,其活性代表了組織清除自由基的能力，SOD缺乏更加容易受到氧化損傷[24]。氧化應(yīng)激過程中，自由基的增加會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化加速，MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物,可間接反映體內(nèi)氧自由基的代謝狀況和機體細胞受自由基損害的程度[25]。HO-1作為機體抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵保護因子，在氧化應(yīng)激下通過抗氧化、抗凋亡等機制發(fā)揮保護作用，減輕缺血再灌注損傷[26-27]。在本研究中，經(jīng)手術(shù)構(gòu)建70%肝缺血再灌注模型后，小鼠肝組織中MDA明顯增加，SOD及GSH水平明顯降低，表明HIRI小鼠抗氧化能力極大程度降低，發(fā)生了嚴重的氧化應(yīng)激損傷。而通過腹腔注射T-Ⅰ預(yù)處理，與IR組相比，小鼠肝組織中MDA降低，SOD及GSH的水平回升，表明T-Ⅰ可明顯提高肝組織的抗氧化能力，抑制HIRI對小鼠肝組織的氧化應(yīng)激損傷。HE染色、免疫組化等結(jié)果顯示T-Ⅰ預(yù)處理后可減輕肝組織病理損傷，抑制肝細胞凋亡，增強抗氧化因子HO-1的表達。

綜上所述，從丹參中提取的T-Ⅰ可明顯緩解HIRI，提示T-Ⅰ可能是一種具有明顯保肝護肝作用的候選藥物，作用機制可能與其抑制肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡有關(guān)。但T-Ⅰ卻還擁有抗炎、誘導(dǎo)保護性自噬[22]等作用，在本實驗中T-Ⅰ是否可通過其他途徑從而對肝缺血再灌注產(chǎn)生保護作用猶未可知。盡管T-Ⅰ在體外和體內(nèi)模型中均顯示出重要的生物學特性，但其不良的溶解性和生物利用度限制了其臨床應(yīng)用[28-29]。進一步探討T-Ⅰ在HIRI中的調(diào)控機制，改進T-Ⅰ的藥物制劑將可能為HIRI的治療提供新的方法及理論依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：易小康、杜毅超、錢保林、付文廣等負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；易小康、黃治偉、溫劍等參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；李秋、付文廣、溫劍等負責擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。