時(shí)丕彪，胡鳳琴，顧小兵，呂遠(yuǎn)大

（1.鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，江蘇鹽城224049；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，江蘇南京210008 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇南京210014；）

Rab蛋白是一類小分子量三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate,GTP）結(jié)合蛋白，主要參與細(xì)胞器間的膜轉(zhuǎn)運(yùn)，將貨物蛋白通過囊泡運(yùn)輸?shù)侥康牡豙1]。GTP結(jié)合蛋白在GTP與之結(jié)合時(shí)被激活，在GTP水解為GDP過程中失活，因此這類蛋白在這些過程中起著分子開關(guān)的作用[2-3]。Rab基因家族是植物重要的一類超大基因家族。研究表明，Rab家族不僅與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，而且在逆境脅迫和抗病方面也發(fā)揮著重要的作用[4]。目前，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)57個(gè)Rab蛋白，并將其分為8個(gè)亞家族：RabA～H[5]。T-DNA插入突變體試驗(yàn)表明，AtRabD2b和AtRabD2c在擬南芥花粉發(fā)育和花粉管生長(zhǎng)方面起著重要的作用，并且它們?cè)诠δ苌鲜侨哂嗟腫6]。煙草中過量表達(dá)NtRab2基因會(huì)抑制花粉管的生長(zhǎng)[7]。而將御谷PgRab7基因轉(zhuǎn)入煙草中能顯著增強(qiáng)煙草對(duì)干旱脅迫和鹽脅迫的耐受性，說明PgRab7基因可能參與了植物脅迫響應(yīng)[8]。在轉(zhuǎn)基因水稻中過表達(dá)OsRab11基因，發(fā)現(xiàn)通過影響茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了植株對(duì)病原菌的抗性[9]。TaRab7基因在小麥與條銹菌互作早期和抗逆性中起著重要的作用[10]。PtRabE1b的過量表達(dá)增強(qiáng)了楊樹的耐鹽性[11]。

玉米為世界上重要的糧食作物之一，關(guān)于Rab基因在玉米中的研究較少。因此，本研究克隆了玉米ZmRab6A基因并對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)定，分析了其編碼蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及與其他物種的親緣關(guān)系等特征，為下一步研究其分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

玉米材料為筆者所在課題組保存的玉米自交系B73。取健壯幼苗的葉片組織，液氮速凍后保存在-80℃冰箱用于RNA提取。

1.2 玉米總RNA提取及cDNA合成

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說明書提取玉米葉片總RNA。按照美國(guó)Thermo Scientific公司的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1條鏈，作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3 玉米ZmRab6A基因的克隆

根據(jù)GeneBank登錄的ZmRab6A基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)基因特異性引物，正向引物F：5'-CCCTGGT CTGTGGCCTCTGCGCTCC-3'，反向引物R：5'-TTATTTCGAAACAAAAGACCCGGTGT GATTC-3'，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積50μL，其中2×Taq Master Mix 25μL，cDNA模板1μL，正反向引物各1μL，ddH2O 22μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物膠回收后連接到pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。菌液PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性單菌落的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 ZmRab6A基因的生物信息學(xué)分析

利用ORF finder在線分析ZmRab6A基因的開放閱讀框架并翻譯成氨基酸，利用Ex PASy Prot Param預(yù)測(cè)ZmRab6A編碼蛋白的相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)，分別使用在線軟件GORⅣ和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，用國(guó)家生物技術(shù)信息中心的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI CDD分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，Prot Scale在線預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性，分別利用SignalP-5.0和TMHMM Server v.2.0分析信號(hào)肽和跨膜區(qū)域的有無，采用蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)工具PSORT預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。使用MEGA 5.05軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）（自展值bootstrap=1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmRab6A基因的克隆

利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，從玉米葉片中克隆得到ZmRab6A基因1 044 bp的cDNA全長(zhǎng)序列（圖1）。序列分析表明，該基因含有1個(gè)660 bp的開放閱讀框，編碼219個(gè)氨基酸；5'非翻譯區(qū)長(zhǎng)155 bp，3'非翻譯區(qū)長(zhǎng)229 bp（圖2）。在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)2 650 bp。

2.2 ZmRab6A的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy ProtParam分析ZmRab6A蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明：其分子式為C1076H1726N288O338S9，相對(duì)分子量為24.39 ku，理論等電點(diǎn)為5.58；帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）28個(gè)，帶正電荷殘基（Arg+Lys）26個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪族指數(shù)分別為46.68和86.76，推測(cè)ZmRab6A為不穩(wěn)定蛋白。

2.3 ZmRab6A蛋白的親/疏水性分析

利用ProtScale預(yù)測(cè)ZmRab6A蛋白的親水性/疏水性，結(jié)果如圖3所示，該蛋白的N末端有一個(gè)很強(qiáng)的疏水性結(jié)構(gòu)，第128位和129位異亮氨酸（Ile）疏水性最強(qiáng)，分值為2.344；C末端有一個(gè)很強(qiáng)的親水性結(jié)構(gòu)，第209位絲氨酸（Ser）親水性最強(qiáng)，分值為-2.600。該蛋白的總平均親水性值為-0.173，推測(cè)其可能是親水蛋白。

2.4 ZmRab6A的跨膜區(qū)域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用TMHMMServer v.2.0預(yù)測(cè)ZmRab6A蛋白的跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示，該蛋白沒有跨膜螺旋區(qū)，屬于非跨膜蛋白質(zhì)（圖4）。使用SignalP-5.0預(yù)測(cè)ZmRab6A信號(hào)肽的可能性，其值為0.004，因此該蛋白沒有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白（圖5）。

2.5 ZmRab6A蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ZmRab6A具有Rab蛋白典型的G結(jié)構(gòu)域（G1、G2、G3、G4和G5），具有Rab6特異性位點(diǎn)，含有GTP/Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，Rab蛋白特征序列RabF1、RabF2、RabF3、RabF4和RabF5，Rab亞家族序列RabSF1、RabSF2、RabSF3和RabSF4，開關(guān)Ⅰ、Ⅱ區(qū)域，同時(shí)還包含GEF互作位點(diǎn)、GDI互作位點(diǎn)和效應(yīng)器互作位點(diǎn)，屬于P-loop_NTPase超家族。

2.6 ZmRab6A蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

PSORT預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ZmRab6A主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜（45%），其次是葉綠體類囊體膜（28%）、葉綠體基質(zhì)（20%）和葉綠體類囊體空間（20%）。因此，推測(cè)ZmRab6A可能是一種胞質(zhì)蛋白。

2.7 ZmRab6A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ZmRab6A蛋白主要由α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈構(gòu)成，其中無規(guī)卷曲占比最大，為39.73%；其次是α-螺旋，占比37.90%；延伸鏈占22.37%（圖6-A）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ZmRab6A蛋白的空間結(jié)構(gòu)主要是無規(guī)卷曲和α-螺旋，含有少量延伸鏈，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖6-B）。

2.8 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

基于NCBI的nr（non-redundant protein）蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLASTP程序，比對(duì)得到其他物種Rab蛋白的氨基酸序列。序列比對(duì)結(jié)果表明，ZmRab6A蛋白與高粱（Sorghum bicolor，XP_002461043.1）的一致性最高，達(dá)94%；其次是狗尾草（Setaria viridis，XP_034580146.1）和谷子（Setaria italica，XP_022679 790.1），均達(dá)92%；與菠蘿（Ananas comosus，XP_020 104318.1）、藜麥（Chenopodium quinoa，XP_02176572 6.1）、牽牛（Ipomoea nil，XP_019177322.1）、罌粟（Papaver somniferum，XP_026401556.1）、美花煙草（Nicotiana sylvestris，XP_009766624.1） 和 番 茄（Solanum lycopersicum，XP_004229706.1）的一致性分別為87%、86%、86%、85%、85%和85%；與亞麻芥（Camelina sativa，XP_010437115.1）、大 葉 藻（Zostera marina，KMZ76111.1）和 一 串 紅（Salvia splendens，TEY33177.1）的一致性分別為76%、76%和75%；與狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，XP_019416581.1）和 野 生 大 豆（Glycine soja，KHN31372.1）的一致性均為67%。以上均表現(xiàn)出較高的同源性。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，玉米與同屬禾本科的高粱、狗尾草和谷子的Rab6A蛋白處于同一分支，親緣關(guān)系最近；與一串紅、亞麻芥和大葉藻的Rab6A親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與豆科植物野生大豆和狹葉羽扇豆的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖7）。

3 討論與結(jié)論

Rab GTP結(jié)合蛋白作為囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白，參與了囊泡從供體細(xì)胞器出芽、與靶膜對(duì)接、拴系和融合的整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)過程[12-13]。Rab家族在酵母、哺乳動(dòng)物和高等植物中具有高度的保守性[14]，為生物有機(jī)體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)提供了一致的基礎(chǔ)。目前，擬南芥Rab蛋白家族已被鑒定和詳細(xì)分析。每個(gè)Rab成員約有200個(gè)氨基酸，并且序列具有高度相似性。所有Rab蛋白均具有5個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域，包括4個(gè)鳥嘌呤核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（G1、G3、G4和G5）與1個(gè)效應(yīng)器結(jié)合結(jié)構(gòu)域（G2）[3,15]。其中，G1是磷酸或Mg2+的結(jié)合位點(diǎn)，G4和G5是參與GTP-GDP結(jié)合和水解的關(guān)鍵位點(diǎn)。Rab在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。例如，Rab蛋白影響著花粉管的生長(zhǎng)[7]、葉片形態(tài)[16]、木質(zhì)部發(fā)育[17]、自噬[18]、鹽分脅迫[19]和病原菌防御[16]等。小分子量GTP結(jié)合蛋白R(shí)ab6主要是調(diào)控囊泡從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆向運(yùn)輸[20]。研究表明，AtRab6A與擬南芥根系發(fā)育密切相關(guān)[21]；OsRab6A參與調(diào)控水稻生長(zhǎng)、糧食產(chǎn)量和鐵元素的積累以響應(yīng)大氣中升高的CO2濃度[22]。

本研究以玉米ZmRab6A基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用RT-PCR技術(shù)成功克隆了該基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并在DNA水平上分析了其基因結(jié)構(gòu)。采用各種生物信息學(xué)軟件對(duì)其編碼蛋白ZmRab6A的理化性質(zhì)、親/疏水性、保守結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ZmRab6A基因cDNA全長(zhǎng)1 044 bp，含有1個(gè)660 bp的開放閱讀框，編碼219個(gè)氨基酸；在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)2 650 bp；ZmRab6A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)多為無規(guī)卷曲和α-螺旋，是一種無跨膜區(qū)域和信號(hào)肽的不穩(wěn)定親水性胞質(zhì)蛋白，具有G結(jié)構(gòu)域和Rab6特異性位點(diǎn)，屬于P-loop_NTPase超家族蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，玉米ZmRab6A與高粱、狗尾草和谷子中的親緣關(guān)系最近，這與植物分類地位一致。以上研究為后續(xù)探討ZmRab6A的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。