秦丹丹，杜 靜，許甫超，徐 晴，葛雙桃，彭嚴(yán)春，董 靜*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064；2.長江大學(xué)，湖北荊州434200）

大麥?zhǔn)鞘澜缫彩俏覈谒拇蠊阮愖魑?，具有食用、飼用、釀造、保健等多重用途。但是，長期以來，我國的大麥生產(chǎn)自給率較低、對(duì)外依存度高。根據(jù)海關(guān)數(shù)據(jù)，2019年1—11月，我國從加拿大、澳大利亞等大麥主要出口國進(jìn)口大麥596萬t。自2020年5月19日起，我國對(duì)原產(chǎn)于澳大利亞的進(jìn)口大麥征收反傾銷稅。這項(xiàng)舉措既為大麥育種工作者提供了機(jī)遇，同時(shí)也提出了挑戰(zhàn)?，F(xiàn)階段，為快速有效地將我國大麥從長期依賴進(jìn)口的困境中解脫出來，保障國家糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定，優(yōu)異專用型大麥新品種的培育工作仍然是育種工作者工作中的重中之重。

在大麥新品種選育過程中，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)是首要任務(wù)。在分子水平上對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，了解其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，有助于我們更有針對(duì)性地、更準(zhǔn)確地選擇雜交親本，在后代中獲得優(yōu)良變異，從而為大麥雜種優(yōu)勢(shì)利用及新品種選育提供可利用的信息[1]。隨著Saghai-Maroof等首次利用4個(gè)簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記對(duì)207份大麥種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行研究[2]后，AFLP[3]、RAPD[4]、SSR[2]以及新近發(fā)展的SNP[5]等各種類型的分子標(biāo)記在大麥遺傳多樣性研究中都得到了應(yīng)用。其中，SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，因其多態(tài)性高、數(shù)目多、操作簡單、易于鑒別、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)而在大麥的遺傳多樣性研究中被國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用[6-9]。

本研究在對(duì)416對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)上，利用其中多態(tài)性穩(wěn)定可靠、條帶清晰的53對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)157份國內(nèi)外大麥種質(zhì)資源（多為長江中下游麥區(qū)選育品種，包含筆者所在單位自育品種）進(jìn)行了遺傳多樣性分析，旨在從分子水平上揭示筆者所在單位所收集保存的大麥種質(zhì)間的親緣關(guān)系，為后期雜種優(yōu)勢(shì)利用及突破型大麥新品種選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究參試材料為157份來源于國內(nèi)外的大麥種質(zhì)資源，以長江中下游麥區(qū)自育品種為主，其中來自湖北?。ǘ跸盗小⑷A系列、楚系列、荊系列等）、江蘇?。ㄌK系列和揚(yáng)系列）、浙江?。ㄕ阆盗校┖秃幽鲜。v系列）的材料分別有34、14、6和9份，均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所麥類育種課題組收集、創(chuàng)制和保存，材料名稱詳見表1。

1.2 SSR分子標(biāo)記的擴(kuò)增方法

田間取各材料新鮮健壯的葉片，采用CTAB法提取DNA，SSR引物來源于Graingene（http://wheat.pw.usda.gov/GG3），由上海英駿公司合成。10μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中包含模板DNA（50 ng/μL）1.0～1.5μL，正向引物（10μmol/L）和反向引物（10μmol/L）各1μL，2×Takara Master Mix 5μL，ddH2O 1.5～2.0μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5 min；35個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?4℃30 s，58℃30 s，72℃30 s；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并通過硝酸銀染色法顯色。

1.3 帶型統(tǒng)計(jì)和分析

將SSR分析中的任一擴(kuò)增帶看作一個(gè)等位位點(diǎn)，根據(jù)多態(tài)性引物擴(kuò)增條帶的有無，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，建立1，0型二元數(shù)據(jù)矩陣。采用Nei-li指數(shù)法，計(jì)算樣本間遺傳相似系數(shù)（GS）[12]。GS=2Nij/（Ni+Nj），式中：Nij是指材料i和j共有的片段數(shù)目；Ni和Nj分別為材料i和材料j中出現(xiàn)的片段數(shù)目。用NTsys 2.10e軟件，根據(jù)非加權(quán)平均值的方法，繪制基于遺傳距離的算術(shù)平均值的非加權(quán)對(duì)群方法（Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages，UPGMA）聚類圖，用于群體間遺傳關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

本研究首先利用來源差異較大的24份大麥種質(zhì)對(duì)416對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選。根據(jù)分型結(jié)果，共篩選出117對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好且差異明顯的多態(tài)性引物。在157份大麥種質(zhì)中對(duì)這117對(duì)引物進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中54對(duì)引物在較大群體中仍然表現(xiàn)為多態(tài)性穩(wěn)定，大麥的1H～7H染色體上分別有7、7、6、8、8、8和10條（表2），將這部分結(jié)果用于后續(xù)遺傳多樣性分析。

表2 54對(duì)SSR引物序列、位置及擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)目

續(xù)表

2.2 引物在供試材料中的多態(tài)性位點(diǎn)信息

進(jìn)一步對(duì)54對(duì)多態(tài)性引物在大麥種質(zhì)資源中的擴(kuò)增和分型結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，每對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為1～7條帶，如Bmag0206擴(kuò)增產(chǎn)物只有1條帶，Ebmac0701擴(kuò)增產(chǎn)物有6條帶，而Bmag0496擴(kuò)增產(chǎn)物多達(dá)7條（表2）。54對(duì)引物共擴(kuò)增出188條清晰可辨的條帶，其中172條具有多態(tài)性（表2），多態(tài)性比率為91.5%。

2.3 供試材料的聚類分析

根據(jù)SSR分析所得的1,0型數(shù)據(jù)聚類并作圖（圖1），由聚類圖可見，相似系數(shù)分布范圍為0.542 8～0.930 4。其中，G033T034U和永4783遺傳相似系數(shù)最高，為0.930 4，表明兩者親緣關(guān)系最近。城間大麥和通99-36遺傳相似系數(shù)最低，為0.542 8，兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。為了更好地表示157個(gè)品種之間的親緣關(guān)系，在遺傳相似系數(shù)GS≥0.665 7，將供試的157份大麥種質(zhì)分成了5大類。

第一大類共包括6份材料，有Morex、GAMMA、城間大麥、PALLLDUM、ODESSKIY和鄂大麥9706。

第二大類共包括29份材料，有鄂大麥10號(hào)、創(chuàng)大麥43、廣豐3號(hào)、揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)、駐5-189、揚(yáng)農(nóng)啤1號(hào)、揚(yáng)農(nóng)啤6號(hào)、03IN9-42、Harrington、甘墾5號(hào)、G033T034U、永4783、G033T059U、G033T025U、駐96005矮裸、日喀則-2、03IN5-212、揚(yáng)農(nóng)啤8號(hào)、Ecjotic、03IN5-156、03IN5-180、日喀則-1、日喀則S-1、ZDM9950、日喀則S-2、03IN5-20、蘇啤4號(hào)、品5804和Manker。

第三大類共包括15份材料，有華大麥4號(hào)、華2236、華2539、永4564、荊02-248、駐97017-2-1、東84342-1、DMAS004、浙皮1號(hào)單、揚(yáng)農(nóng)啤8號(hào)*、揚(yáng)農(nóng)啤8號(hào)**、Z134V065W、甘肅2012引、Z212V009W和cherron。

第四大類共包括45份材料，由2個(gè)亞類組成。第一亞類有Djerlo、03IN5-232、BADORIY、駐大麥7號(hào) 和03IN5-298。第 二 亞 類 包 括 華2151、Z212V025W、S-192、華2328、鳳 大 麥7號(hào)、Z188V023W、鄂大麥9號(hào)、浙5819、太福1號(hào)、甘墾6號(hào)、華2162、莆系14、閩保、03京2025-2026、莆大麥7號(hào)、華2114、XYL-601、鄂大麥7號(hào)、G231M004M、揚(yáng)農(nóng)啤9號(hào)、Kharkovski、矮單2-8、矮壯21、申河085、駐大麥5號(hào)、浙3521、蘇啤3號(hào)、駐大麥5號(hào)*、關(guān)東黃金、蘇啤6號(hào)、駐大麥998、浙3521*、云大麥2號(hào)、WDM7127、駐大麥6號(hào)、墨P、甘啤5號(hào)、WDM7140、通99-36和G049T060U。

第五大類共包含62份材料，也由2個(gè)亞類組成。第一亞類包括華2005、鄂大麥8號(hào)、鄂大麥68231、鄂大麥766、鑒75、陜引1號(hào)、C54S-1皮、閩誘3號(hào)、JB05-06、C54S-1藍(lán)、85G46、鄂大麥883、楚0709、鄂大麥065、YN21、Goldenpromise、閩麥2號(hào)、花11、二芒大麥、釀造二條*、浙08-92、花30、揚(yáng)農(nóng)啤7號(hào)、青海-4、青海-6、杭農(nóng)-81、Athes、entry26、單二、揚(yáng)輻6008、鄂大麥886、云南-1、釀造二條、鄂大麥507、蒲09019、鄂大麥610、鄂6741、鄂大麥588、AcStephen、BBD-40、鳳18-11和鄂啤2號(hào)，共42份材料。第二亞類包括華2759、鄂大麥6號(hào)、揚(yáng)農(nóng)啤2號(hào)、楚大麥38、品比5755、荊02-461、華2255、駐3-257、保大麥12號(hào)、烏金3號(hào)、浙07-6、揚(yáng)農(nóng)啤4號(hào)、云飼麥1號(hào)、華大麥12、I-2、楚09-05、華10118、華2908、03IN5-152和03IN5-154，共20份材料。

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源的篩選、鑒定和評(píng)價(jià)是進(jìn)行作物遺傳改良的基礎(chǔ)，而分析現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳多樣性，尤其是在分子水平上，有助于我們更精準(zhǔn)地了解材料間的親緣關(guān)系，從而有選擇性地開展親本組配工作。本研究在對(duì)400余對(duì)SSR引物進(jìn)行初步篩選的基礎(chǔ)上，挑選出54對(duì)多態(tài)性穩(wěn)定且清晰可辨的引物，這些引物均勻分布在大麥1H～7H染色體上，基本覆蓋大麥的整個(gè)基因組，具有一定的代表性。隨后利用這54對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)157份國內(nèi)外大麥種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期為本單位的大麥新品種選育工作提供依據(jù)。雖然AFLP[3]、RAPD[4]、SSR[2]以及新近發(fā)展的SNP[5]等各種類型的分子標(biāo)記在大麥遺傳多樣性研究中都得到了應(yīng)用，但是SSR仍是目前進(jìn)行大麥遺傳多樣性初步分析中首選的標(biāo)記類型，并被廣泛應(yīng)用于大麥DUS測(cè)定[13]、農(nóng)藝性狀[14]、抗旱性[15]、耐鹽性[16]以及抗病性[17]等性狀的關(guān)聯(lián)分析等研究。

雖然國內(nèi)外學(xué)者利用SSR標(biāo)記開展了多項(xiàng)關(guān)于大麥不同種質(zhì)遺傳多樣性的研究，但是各研究所選的SSR標(biāo)記卻大不相同，很少有共同的標(biāo)記。本研究篩選出的54對(duì)引物中，與部分其他研究相比，如92個(gè)用于分析108份青稞親本材料的SSR標(biāo)記[14]、27對(duì)用于分析我國西藏與中東地區(qū)近緣野生大麥遺傳多樣性的SSR標(biāo)記[18]、用于分析61個(gè)國家2 625份大麥種質(zhì)遺傳多樣性的35對(duì)SSR引物[19]和42對(duì)用于分析以色列不同地區(qū)的144份野生大麥遺傳多樣性的SSR標(biāo)記[20]，都分別只有5～6個(gè)共同標(biāo)記。這些研究相互之間的共同標(biāo)記數(shù)目也很少，一方面可能是由于各單位所保存的SSR標(biāo)記中相互間共同的本身就比較少，另一方面也可能是由于所選用的材料來源范圍不同。目前，為了避免不必要的重復(fù)，更高效地評(píng)價(jià)大麥種質(zhì)的遺傳多樣性，筆者認(rèn)為，在未來的工作中，還急需篩選一套通用的、科學(xué)的、具有代表性并可用于評(píng)價(jià)種質(zhì)真實(shí)性或者多樣性的SSR引物。

本研究發(fā)現(xiàn)本課題組所保存的擁有相同名稱的材料，在聚類分析中可能處于不同類，如揚(yáng)農(nóng)啤8號(hào)、揚(yáng)農(nóng)啤8號(hào)*和揚(yáng)農(nóng)啤8號(hào)**分別屬于第二大類和第三大類（圖1）。這些材料系不同年份從不同地點(diǎn)或單位引進(jìn)的，它們?cè)诜肿铀缴系牟町愐环矫婵赡苁怯捎诟鲉挝幌嗷ヒN時(shí)存在偏差，另一方面也可能是材料在保存或繁殖過程中出現(xiàn)了混雜。

與多數(shù)聚類分析結(jié)果[21-22]類似，本研究也發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與材料的來源相對(duì)一致，如來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的鄂大麥品種（系）除鄂大麥10號(hào)、鄂大麥7號(hào)、鄂大麥9號(hào)、鄂大麥6號(hào)外，都聚在第五大類第二亞類。第五大類還包含了另外的湖北省自育品種，如荊系列和華系列。而來自西藏日喀則地區(qū)的大麥品種聚在第二大類，來自河南省的駐大麥品種（系）大多聚在第四大類，少數(shù)的國外品種夾雜在各個(gè)類群中。說明國內(nèi)的大麥育種普遍存在遺傳基礎(chǔ)相對(duì)單一的問題，這種現(xiàn)象不利于災(zāi)害嚴(yán)重年份中大麥穩(wěn)產(chǎn)，在生產(chǎn)上具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。這就要求在育種中加強(qiáng)外來種質(zhì)資源的利用，擴(kuò)寬遺傳基礎(chǔ)。事實(shí)上，近年來，國內(nèi)的各大麥育種單位包括筆者所在團(tuán)隊(duì)也多次從加拿大、澳大利亞等大麥主要出口國引進(jìn)部分優(yōu)異種質(zhì)資源。但是，從筆者所在團(tuán)隊(duì)的育種實(shí)踐來看，受國內(nèi)外生態(tài)環(huán)境不同的影響，這些種質(zhì)在當(dāng)?shù)氐谋憩F(xiàn)可能與品種本來的表現(xiàn)不同。例如，從加拿大引進(jìn)的種質(zhì)就存在普遍偏高的缺點(diǎn)，導(dǎo)致這些種質(zhì)很難在育種中直接利用。針對(duì)這些種質(zhì)，我們一方面應(yīng)該進(jìn)行多年的綜合農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)，另一方面，也需要對(duì)其進(jìn)行分子層面上的解析，通過分子標(biāo)記輔助育種或者基因編輯等策略有目的地進(jìn)行利用。