陳珊雅 彭良玉 王喜連 周忠群 唐 杰 謝 斌 陳素昌

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院1 疼痛科；2 麻醉科，衡陽 421001）

大量的研究證實溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid, LPA) 在神經(jīng)病理性疼痛的啟動和維持中起著重要的作用，這意味著LPA 是治療神經(jīng)病理性疼痛的一個重要的靶點(diǎn)。我們的前期研究也證實，鞘內(nèi)注射LPA 可以誘導(dǎo)背根神經(jīng)脫髓鞘產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。醫(yī)用臭氧 (ozone, O3) 在臨床上被用于治療各種形式的疼痛包括帶狀皰疹后神經(jīng)疼痛和三叉神經(jīng)痛[1,2]，這說明臭氧治療神經(jīng)病理性疼痛效果較好。國內(nèi)外對醫(yī)用臭氧在動物實驗中對神經(jīng)病理性疼痛的研究較少，關(guān)于臭氧在LPA 誘導(dǎo)的脫髓鞘神經(jīng)病理性疼痛中的作用尚未見研究報道，臭氧在神經(jīng)病理性疼痛的具體作用機(jī)制目前不明。炎癥因子，如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) 在神經(jīng)病理性疼痛啟動中的作用也一直被受重視。而髓鞘相關(guān)糖蛋白 (myeline-associated glycoprotein, MAG) 在髓鞘的形成和維持中也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。本研究將探討單次椎間孔注射 (intervertebral foramen injection, IVF) 臭氧在LPA 脫髓鞘神經(jīng)病理性疼痛模型中對TNF-α 及MAG 表達(dá)的影響。

方 法

1. 實驗動物

本研究采用健康成年雄性小鼠（體重20～24 g），動物由南華大學(xué)動物中心提供。室溫保持50%～60%的濕度和在22±2℃，12 h/12h 黑夜-白天循環(huán)照明。動物在安靜環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，能自由攝取食水。所有實驗步驟都盡量減輕動物的痛苦并按照有關(guān)實驗動物的使用原則操作。LPA 脫髓鞘疼痛模型制作：LPA 鞘內(nèi)注射采用Hylden 和Wilcox等[3]描述的方法，在L5和L6之間的間隙進(jìn)行。造模后，將小鼠隨機(jī)分為人造腦脊液組（LPA + aCSF組）及臭氧組（LPA + O3組），椎間孔臭氧或aCSF 注射按照Ferrari 等[4]描述的方法，在L5左側(cè)椎間孔處注射。于注射LPA 前 (t0)、注射LPA 后24 h且注射臭氧或aCSF 前(t1)、注射臭氧或aCSF 后24 h (t2)、3 天 (t3)、7 天 (t4)、14 天 (t5)時測定小鼠機(jī)械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)及熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)，每組8 只，共48 只，并在不同時間點(diǎn)(t0、t1、t2、t3、t4) 取其背根神經(jīng)采用Western blot 方法測定MAG、TNF-α 的表達(dá)變化，每組3 只，共30 只。

2. 動物行為學(xué)測定

（1）MWT 測定：機(jī)械痛敏測試裝置為透明的有機(jī)玻璃箱，無底，箱底為金屬網(wǎng)制成（網(wǎng)格為6 mm×6 mm）。在動物行為學(xué)測試前為了消除心理因素，把小鼠首先放入有機(jī)玻璃箱適應(yīng)1 h，直至小鼠搔抓、洗臉、行走等活動完全停止，處于安靜狀態(tài)時為止。用傳感器指針（美國IITC 電子vonFrey 測痛儀 1601）通過網(wǎng)格垂直刺激小鼠左后肢的足心部。引起小鼠左后肢回縮的壓力值即定義為MWT。設(shè)定20 g 的壓力值為分界點(diǎn)，避免組織損傷，以10 min 的間隔對左后肢重復(fù)測量3 次，3 次的均值用于最后的統(tǒng)計學(xué)分析。

（2）TWL 測定：熱痛敏的測試裝置為有機(jī)玻璃箱，無底，箱底為可以加熱的玻璃平板。在動物行為學(xué)測試前為了消除心理因素，把小鼠首先放入有機(jī)玻璃箱適應(yīng)1 h，直至小鼠搔抓、洗臉、行走等活動完全停止，處于安靜狀態(tài)時為止。將熱刺激器（美國IITC）放在玻璃平板的下面，投射光源的焦點(diǎn)正對小鼠的左后肢的足心部。通過熱刺激器上的鏡子可以看到小鼠的腳底面。設(shè)定20 s 為界點(diǎn)，避免組織損傷。以10 min 的間隔對左后肢重復(fù)測量3 次，3 次的均值用于最后的統(tǒng)計學(xué)分析。

3. 給藥方法

LPA 是由人工腦脊液 (aCSF: 125 mM NaCl, 3.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, pH 7.4) 溶解。鞘內(nèi)注射是采用Hylden 和Wilcox等描述的方法。以左掌壓住鼠身，拇、中指按住腰骶部兩側(cè)固定，食指按在雙側(cè)骶骨前緣連線正中點(diǎn)（可觸及L5棘突）指示進(jìn)針點(diǎn), 以微量注射器自L5和L6之間的間隙進(jìn)針。臭氧注射按照Ferrari 等描述的方法。以微量注射器在L5左側(cè)椎間孔處注射30 μg/ml 臭氧 30 μl。

4. Western 印跡法測定MAG 和TNF-α 表達(dá)

取出不同時段、臭氧和aCSF 處理后的小鼠L4-5雙側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，切割成四等份，按重量分別加入Tris 裂解緩沖液（50 mMTris-Hcl, PH6.8; 2%SDS; 10%甘油；ddH2O。使用前要加蛋白酶抑制劑），低溫勻漿，超聲破碎，1 5000 rpm 低溫離心后取上清液。用Micro-BCA (Micro BCA Protein Assay Kit pierce) 法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品(20 μg)加入2 μl 上樣緩沖液，混勻后，沸水煮沸10 min。取煮沸后的等量蛋白樣品約30 μl，加入SDS-PAGE膠孔中，于80 V 恒壓，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后濃縮膠電泳60 min，再100 V 恒壓，分離膠電泳90 min。將完整的凝膠取下，轉(zhuǎn)移到鋪著海綿和濾紙轉(zhuǎn)移夾中組成“三明治”結(jié)構(gòu)，把事先在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10 min 的PVDF 膜 (Millipore Japan) 緊貼其上，排除氣泡，再在轉(zhuǎn)移緩沖液中380 mA 恒流轉(zhuǎn)移90 min。取出PVDF 膜，在TBS 中輕搖5 min，用封閉液（TBST, 5%w/v 脫脂奶粉）25℃封閉2 h在10 ml 一 抗 [anti-MAG (1:500, Chemicon, USA) , anti-TNF-α (1:1000, Sigma USA)] 稀釋液中(TBST, 5%w/v BSA)把PVDF 膜和一抗共同輕搖孵育，4℃過夜。次日，用TBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min。然后用10 ml 過氧化物酶標(biāo)記的二抗[anti-MAG (1:500, Chemicon, USA) anti-TNF-a (1:1000, Sigma, USA)] 孵育, 25℃2 h 。用TBST 清洗PVDF 膜，洗脫3 次, 每次10 min，后用1 ml ECL (Pierce chemical, USA) 室溫孵育3 min。排出過量液體，在暗室中使其與X 光片(Kodak, Rochester, NY)緊密接觸，使X 光片感光數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影，定影，沖洗，晾干，掃描并進(jìn)行計算機(jī)圖象分析。PVDF膜用strip 液50℃洗脫30 min 后重新封閉及加一抗二抗，以β-tubulin [rabbit anti-?-tubulin polyclonal antibody (Santa cruz USA) 1:500] 作為內(nèi)參確認(rèn)上樣量基本相同。

圖1 熱閾值和機(jī)械性閾值(n = 8, ±SD) (A) 不同組之間的熱縮足反射潛伏期變化的比較；(B) 不同組之間的機(jī)械縮足反射閾值變化的比較 *P < 0.05，與LPA-aCSF 組相比；t0：注射LPA 前；t1：注射LPA 后24h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天Fig. 1 Thermal withdrawal latency and mechanical withdrawal threshold (n = 8, ±SD) (A) The comparison of thermal withdrawal latency (TWL) in two groups; (B) The comparison of mechanical withdrawal threshold (MWT) in two groups *P < 0.05, compared with the group LPA-aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection；t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

5. 統(tǒng)計學(xué)分析

針對行為學(xué)縮足閾值的評估，采用Graph Pad Prism 7.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，采用雙因素方差 (twoway ANOVA) 分析。P< 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western-blotting 的結(jié)果：膠片用imageJ 進(jìn)行條帶密度分析，采用雙因素方差(two-way ANOVA) 分析。P< 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.小鼠熱閾值及機(jī)械性閾值的變化

兩組鞘內(nèi)注射LPA 后24 h，MWT 和TWL 均明顯降低，LPA + O3組與LPA + aCSF 組相比，椎間孔注射臭氧后24 h 時MWT 和TWL 顯著上升，疼痛緩解，一直持續(xù)至第7 天（P< 0.05，見圖1）。

2. 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經(jīng)TNF-α 表達(dá)的變化

在 椎 間 孔 注 射aCSF 后24 h (t2)、3 天 (t3)，觀察到LPA + aCSF 組背根神經(jīng)TNF-α 表達(dá)較注射aCSF 前 (t1) 變化不大，7 天 (t4) 時表達(dá)有所下降；LPA + O3組在O3注射后24 h (t2)，觀察到背根神經(jīng)TNF-α 表達(dá)較LPA + aCSF 組明顯下降，3 天 (t3) 時最低，維持至第7 天（P< 0.05，見圖2）。

3. 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經(jīng)MAG 表達(dá)的變化

LPA + aCSF 組在椎間孔注射aCSF24 h 后 (t2)，觀察到背根神經(jīng)MAG 的表達(dá)較注射aCSF 前 (t1)明顯下降，第3 天 (t3) 時持續(xù)下降，而第7 天 (t4) 與第3 天 (t3) 無明顯變化；LPA + O3組在O3注射24 h (t2)、3 天 (t3) 時，觀察到背根神經(jīng)節(jié)MAG 的表達(dá)較LPA + aCSF 組明顯增高，維持在注射臭氧前水平，僅第7 天 (t4) 時MAG 表達(dá)較注射臭氧前出現(xiàn)輕微下降（P< 0.05,見圖3）。

圖2 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經(jīng)TNF-α 表達(dá)的變化 (A) 用?-tubulin 標(biāo)化后兩組TNF-α 蛋白定量的統(tǒng)計圖；(B) 兩組不同時間點(diǎn)TNF-α 的Western blot結(jié)果 *P < 0.05,與LPA + aCSF 組相比；t0：注射LPA前；t1：注射LPA 后24 h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天Fig.2 The expression of TNF-α protein in aCSF and LPA + O3 group (A) Statistical graph of TNF-α protein quantification in two groups after ?-tubulin standardization；(B) Western blot results of TNF-α in two groups at different time points. *P < 0.05, compared with group LPA + aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection; t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

圖3 注射人造腦脊液和臭氧后背根神經(jīng)MAG 表達(dá)的變化 (A) 用?-tubulin 標(biāo)化后兩組MAG 蛋白定量的統(tǒng)計圖；(B)兩組不同時間點(diǎn)MAG 的Western blot結(jié)果 *P < 0.05,與LPA + aCSF 組相比；t0：注射LPA前；t1：注射LPA 后24 h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天 Fig. 3 The alterations of MAG protein in aCSF and LPA + O3 group (A) Statistical graph of MAG protein quantification in two groups after ?-tubulin standardization; (B) Western blot results of MAG in two groups at different time points. *P < 0.05, compared with group LPA + aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection; t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

討 論

醫(yī)用臭氧是臭氧和氧氣的混合物, 應(yīng)用于臨床治療已有100 多年的歷史。臭氧具有強(qiáng)烈的刺激性氣味[5]，在常溫下半衰期約20～30 min，數(shù)小時后自然分解。臭氧具有很高的能量, 很快自行分解為氧氣和具有很強(qiáng)氧化能力的單個氧原子。在歐洲、俄羅斯和中國，臭氧對于治療慢性疼痛有很好的可信度和治療效果，臭氧已經(jīng)廣泛用于治療各種形式的疼痛[6～8]。臭氧具有抗炎、抗氧化及鎮(zhèn)痛的作用。另一方面，在臨床上我們通過皮內(nèi)或神經(jīng)節(jié)注射臭氧發(fā)現(xiàn)可以減輕帶狀皰疹后神經(jīng)疼痛和三叉神經(jīng)痛病人的疼痛癥狀[1,2]。在1 例5 年帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的隨訪研究中，通過在皰疹節(jié)段的椎間孔注射臭氧發(fā)現(xiàn)可以減輕病人的自發(fā)性疼痛和觸覺誘發(fā)痛[9]。本研究通過在L5左側(cè)椎間孔單次注射臭氧，發(fā)現(xiàn)小鼠的機(jī)械痛敏及熱痛敏1 天后就明顯下降了，且維持到了第7 天，這與Lu 等[10]在坐骨神經(jīng)壓迫模型中發(fā)現(xiàn)不同濃度及劑量臭氧減輕神經(jīng)病理性疼痛的時間點(diǎn)有很大的相似性，說明了單次劑量的臭氧可以維持很長時間。而且在LPA 脫髓鞘動物模型中的研究與Luo 等[9]發(fā)現(xiàn)的椎間孔注射臭氧可以減輕觸覺誘發(fā)痛是一致的，雖然維持時間未達(dá)到28天。但是關(guān)于不同濃度臭氧及不同劑量臭氧在LPA 脫髓鞘神經(jīng)病理性疼痛中的作用，需要我們進(jìn)一步去探索。

TNF-α 是神經(jīng)損傷以及神經(jīng)炎癥過程中最重要及最早釋放的致炎細(xì)胞因子。在本研究中我們通過單次椎間孔注射臭氧后，觀察到背根神經(jīng)TNF-α 的表達(dá)在注射后12 h 立即表達(dá)下調(diào)，24 h 下降達(dá)到峰值，并維持到第3 天，這證實了在LPA 脫髓鞘神經(jīng)病理性模型中臭氧對TNF-α 有明顯的調(diào)節(jié)作用。但維持時間較短，這可能與臭氧注射方式的不同及臭氧濃度的不同相關(guān)。LPA 啟動神經(jīng)病理性疼痛的一個機(jī)制是誘導(dǎo)外周神經(jīng)的脫髓鞘。髓鞘不僅僅對神經(jīng)動作電位的快速傳導(dǎo)是必需的，還對維持軸突的完整性是非常重要。MAG 是一種跨膜的糖蛋白，選擇性的固定于外周施旺細(xì)胞和中樞少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂鞘的軸突外周（結(jié)旁區(qū)paranode)，因此認(rèn)為其介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞和軸突之間的信號傳遞[11]。P?iv?l?inen 等[12]在離體實驗當(dāng)中證實了MAG 在髓鞘形成當(dāng)中的表達(dá)要早于MBP，所以我們認(rèn)為 MAG 在髓鞘的形成和維持中發(fā)揮著重要的作用。另外，我們前期的試驗研究證實單次鞘內(nèi)注射LPA24 h 后背根神經(jīng)MAG 明顯的下降，一直持續(xù)到第3 天，這也直接說明了MAG 的降解參與了LPA1 受體誘導(dǎo)的背根神經(jīng)脫髓鞘[13]。在本次試驗中。我們通過同節(jié)段L5左側(cè)椎間孔單次注射臭氧，發(fā)現(xiàn)背根神經(jīng)MAG 的表達(dá)未明顯下降，且可以維持MAG 表達(dá)不變到第3 天，直到第7 天的時候才出現(xiàn)下降。這說明臭氧能維持MAG 的完整，第7 天時候的下降與LPA 引起MAG 下降的固有維持時間有關(guān)系。之前我們的實驗研究證實LPA誘導(dǎo)MAG 下調(diào)是通過鈣蛋白酶通路來調(diào)節(jié)，是否臭氧通過抑制上游的鈣蛋白酶來保持MAG 表達(dá)不變，這是我們需要思考和進(jìn)一步研究的。另外，在LAP 誘導(dǎo)的脫髓鞘模型中，我們還觀察到MBP、PMP22、和MPZ 等髓鞘蛋白降解，臭氧是否能抑制這些髓鞘蛋白的降解，這也是我們需要進(jìn)一步探討的。有文獻(xiàn)報道RhoA 信號通路是調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突再生的主要信號通路。抑制Rho 信號通路對于促進(jìn)軸突再生, 減少細(xì)胞死亡, 改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及引起的疼痛, 是一種很好的方法。而轉(zhuǎn)錄因子對于髓鞘形成的調(diào)節(jié)包括正性調(diào)節(jié)和負(fù)性調(diào)節(jié)。Parkinson等[14]2004 年在體外實驗中證實了轉(zhuǎn)錄因子c-Jun 對施旺細(xì)胞的增殖和死亡是必需的，而且在髓鞘形成的時候c-Jun 通過Egr2 下調(diào)。近期的研究也證實非甾體類的消炎鎮(zhèn)痛藥物可通過抑制RhoA 信號通路激活促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生而減輕脊髓損傷的癥狀，而臭氧同樣具有抗炎作用[15]，所以我們下一步的研究也將進(jìn)一步闡述臭氧是否能調(diào)節(jié)上游水平的鈣蛋白酶和RhoA信號通路表達(dá)來減輕神經(jīng)病理性疼痛。

本研究通過探討臭氧在LPA 脫髓鞘神經(jīng)病理性疼痛中對TNF-α 和MAG 表達(dá)的影響來進(jìn)一步闡述臭氧在神經(jīng)病理性疼痛中的具體作用機(jī)制，證實了臭氧能減輕神經(jīng)病理性疼痛，是治療神經(jīng)病理性疼痛的一個很好的方法。