郭寅龍

(中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 上海 200032)

隨著科技進(jìn)步，醫(yī)學(xué)實(shí)踐正向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)邁進(jìn)。大規(guī)模臨床樣本的代謝組學(xué)分析技術(shù)對(duì)于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要，也是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究不可或缺的技術(shù)手段。大規(guī)模疾病代謝組學(xué)的研究對(duì)象為復(fù)雜臨床生物樣本中數(shù)以千計(jì)的代謝物，其涉及的樣本數(shù)量多,分析周期長(zhǎng)，對(duì)現(xiàn)有分析技術(shù)提出了極大挑戰(zhàn)。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是目前代謝組學(xué)分析的主流方法，但色譜分離速度限制了其在大規(guī)模復(fù)雜臨床生物樣本分析中的應(yīng)用。直接進(jìn)樣質(zhì)譜(direct injection-mass spectrometry, DI-MS)已成為除傳統(tǒng)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)之外非靶向代謝組學(xué)研究的另一種選擇，其主要優(yōu)勢(shì)在于快速獲得豐富的代謝物質(zhì)譜信息，顯著提高分析通量。但是DI-MS面臨著離子抑制效應(yīng)導(dǎo)致代謝物檢測(cè)靈敏度降低和缺少色譜維度信息使得定性定量困難等問(wèn)題。因此，發(fā)展與DI-MS相匹配的高靈敏度質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集技術(shù)和先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

針對(duì)上述難題，近日，中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的許國(guó)旺課題組[1]提出了一種基于納升電噴霧電離直接進(jìn)樣高分辨質(zhì)譜(nanoelectrospray ionization direct injection-high resolution mass spectrometry, nanoESI DI-HRMS)的非靶向代謝組學(xué)分析方法，為大規(guī)模代謝組學(xué)研究提供了一種新策略。該方法采用拼接式分段掃描模式采集一級(jí)質(zhì)譜信息，使用數(shù)據(jù)非依賴(lài)(data independent acquisition, DIA)模式采集多個(gè)碰撞能下的二級(jí)質(zhì)譜信息。方法不僅顯著提高了檢測(cè)靈敏度，而且獲得了掃描范圍內(nèi)所有代謝物的質(zhì)譜信息，為后續(xù)回溯性分析提供了可能。該方法結(jié)合代謝物一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)量及同位素分布、二級(jí)質(zhì)譜譜圖相似度及母離子和子離子強(qiáng)度相關(guān)性等標(biāo)準(zhǔn)，使代謝物的定性準(zhǔn)確率高于94%。此外，采用一級(jí)母離子結(jié)合二級(jí)特征碎片離子的方式，對(duì)各種代謝物進(jìn)行定量。對(duì)沒(méi)有干擾的代謝物，采用一級(jí)母離子進(jìn)行定量；對(duì)于含有同分異構(gòu)體的代謝物，采用特征碎片離子進(jìn)行定量。

方法的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在4個(gè)方面：(1) DI-MS提高了分析通量，2～3 min即可完成單個(gè)樣本的分析；(2) DIA模式提高了代謝物的二級(jí)覆蓋度，支持?jǐn)?shù)據(jù)可回溯性分析; (3) 綜合多維度質(zhì)譜信息的定性策略提高了代謝物注釋的可靠性；(4) 特征碎片離子定量法可實(shí)現(xiàn)含同分異構(gòu)體代謝物的定量，方法穩(wěn)定可靠。截至目前，鮮有nanoESI DI-HRMS結(jié)合DIA技術(shù)用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)定性定量研究的報(bào)道，該方法在獲取代謝物一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，將在大規(guī)模人群隊(duì)列樣品的高通量代謝組學(xué)研究中發(fā)揮積極作用。

另一方面，傳統(tǒng)的細(xì)胞代謝組學(xué)研究通常需要數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)代謝組的高覆蓋。減少代謝組學(xué)所需的細(xì)胞數(shù)量有利于拓展研究領(lǐng)域，如對(duì)干細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和從組織獲得的數(shù)目稀少的原代細(xì)胞的研究。數(shù)十個(gè)細(xì)胞的代謝組學(xué)研究不依賴(lài)群體細(xì)胞培養(yǎng)，有利于節(jié)約人力物力，縮短實(shí)驗(yàn)周期，使得細(xì)胞生物學(xué)研究更為便捷。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)數(shù)十個(gè)細(xì)胞的代謝組學(xué)分析方法具有重要意義。基于此，許國(guó)旺課題組[2]在上述工作基礎(chǔ)上，建立了一種nanoESI DI-HRMS拼接式質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集新方法，該方法基于毛細(xì)管微探針的細(xì)胞取樣和96孔板脂質(zhì)在線提取，在3 min內(nèi)可從20個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)到19類(lèi)脂質(zhì)和500多種脂質(zhì)代謝物。

方法優(yōu)越的分析性能主要體現(xiàn)在4個(gè)方面：

(1) 毛細(xì)管微探針可以準(zhǔn)確、快速、可重復(fù)地采集數(shù)十個(gè)細(xì)胞，適用于數(shù)目受限的稀有細(xì)胞分析；(2) 細(xì)胞直接在96孔板中進(jìn)行脂質(zhì)提取，減少了常規(guī)預(yù)處理方法造成的痕量樣本損失; (3) nanoESI DI-HRMS顯著降低了離子抑制效應(yīng)，提高了分析通量；(4) 拼接式質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集顯著提高了檢測(cè)靈敏度，有助于實(shí)現(xiàn)數(shù)十個(gè)細(xì)胞中脂質(zhì)組的廣泛覆蓋。截至目前，數(shù)十個(gè)細(xì)胞代謝組學(xué)分析仍然十分困難，急需好的方法。該工作發(fā)展的方法在細(xì)胞取樣、分析通量、檢測(cè)靈敏度方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，將在循環(huán)腫瘤細(xì)胞等珍稀臨床樣本的代謝組學(xué)分析中發(fā)揮重要作用。

該實(shí)驗(yàn)室上述兩項(xiàng)工作通過(guò)采用拼接式數(shù)據(jù)采集模式的nanoESI DI-HRMS，發(fā)展先進(jìn)的數(shù)據(jù)處理算法，實(shí)現(xiàn)了從20個(gè)細(xì)胞到大規(guī)模人群樣品的快速、高靈敏度的代謝組學(xué)分析。