劉 迪 楊 青 韓 莉 余婷婷 曹 琦 江 豐 王會霞

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

滅草松(Bentazone)又名排草丹、苯達(dá)松[結(jié)構(gòu)式見圖1(a)]，為巴斯夫公司開發(fā)的苯并噻二嗪酮類除草劑，是一類兼觸殺性和內(nèi)吸性除草劑[1-3]，被廣泛應(yīng)用于芽后雜草的防除，可用于水稻、小麥田中除草，對絕大多數(shù)雙子葉植物和莎草科雜草有殺除作用，對禾本科植物無害[4]。滅草松屬于低毒或中等毒性農(nóng)藥，其在水稻和小麥等植物中會被還原代謝成6-羥基滅草松[圖1(b)]或8-羥基滅草松[圖1(c)]，而相應(yīng)的代謝產(chǎn)物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松均具有毒性[8]，對人體有一定的毒性，一般水體污染比較嚴(yán)重[5-7]。

根據(jù)GB 2763—2019規(guī)定，滅草松殘留物定義為滅草松、6-羥基滅草松及8-羥基滅草松之和，以滅草松表示，稻谷和麥類的臨時最大殘留限量為0.1 mg/kg，且沒有規(guī)定法定檢測方法。目前，關(guān)于滅草松的測定方法有氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法[9-10]、離子色譜法[11-12]、液相色譜法[13-14]和液質(zhì)聯(lián)用法[15-18]。實際檢測過程中，氣相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用法一般需要衍生化處理，過程比較繁復(fù)；離子色譜法應(yīng)用相對較少，同時色譜柱的選擇性相對較弱；液相色譜法則存在樣品基體干擾大；而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，選擇性強。同時現(xiàn)有的滅草松殘留檢測建立方法多見滅草松母體，而代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松檢測方法只有液相方法的報道[4]，該方法靈敏度和準(zhǔn)確度不高。目前能同時測定滅草松及其代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法還未見報道。試驗擬以大米和面粉為研究對象，對QuEChERS法提取和凈化方法、液相質(zhì)譜參數(shù)等作優(yōu)化處理，選擇C18吸附劑對樣品作分散固相萃取凈化，建立大米和面粉中滅草松及其代謝物6-羥基滅草松與8-羥基滅草松的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

圖1 滅草松及其代謝物結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structure formula of Bentazone and its metabolites

1 試驗部分

1.1 材料及試劑

滅草松(CAS號：25057-89-0)、6-羥基滅草松(CAS號：60374-42-7)、8-羥基滅草松(CAS號：60374-43-8)標(biāo)準(zhǔn)品：純度>98%，德國DR公司；

大米、小麥粉：市售；

乙腈(CAS號：75-05-8)、甲醇(CAS號：67-56-1)：色譜純，德國默克公司；

乙酸(CAS號：64-19-7)、甲酸(CAS號：64-18-6)：質(zhì)譜純，美國Fisher公司；

無水硫酸鈉(CAS號：15124-09-1)、無水硫酸鎂(CAS號：7487-88-9)：優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)：40～60 μm，博納艾杰爾科技有限公司；

十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)：40～60 μm，博納艾杰爾科技有限公司；

針筒式微孔濾膜：孔徑0.22 μm，材質(zhì)為英國尼龍66(有機系)，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；

超純水：電阻率≥18.2 MΩ·cm(25 ℃)，實驗室自制。

1.2 主要試驗儀器

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Triple Quad 5500，美國AB SCIEX公司；

液相色譜儀：LC-30A型，日本島津公司；

電子分析天平：XS204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

電子分析天平：ME2002E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速離心機：Avanti JXN-30型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

翻轉(zhuǎn)式混勻器：Trayster Digital型，德國IKA公司；

氮吹儀：N-EVAP24型，美國Organomation公司；

渦旋混合器：基本型，美國Talboys公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)對照品的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)對照品儲備溶液 分別準(zhǔn)確稱取滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性和測定需要分別用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)對照品儲備溶液，-20 ℃保存。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)對照品中間溶液 分別準(zhǔn)確吸取1.00 mL 滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于同一個100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即得1.0 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，4 ℃保存。

1.3.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)對照品工作液 取經(jīng)凈化后的空白基質(zhì)溶液1 mL(取樣量與相應(yīng)的試樣處理取樣量相同)，氮氣吹干，用1.00 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液復(fù)溶，過微孔濾膜，濾液待測?；|(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)對照品工作溶液應(yīng)保證現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 準(zhǔn)確稱取已研磨的大米或小麥粉5.00 g于50 mL帶蓋聚乙烯離心管中，先加入10 mL超純水，充分渦旋均勻，靜置30 min。再同時加入10 mL乙腈和0.5 mL 6 mol/L HCl溶液，加入5 g無水硫酸鈉，劇烈振蕩渦旋2 min，翻轉(zhuǎn)提取20 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液置于50 mL離心管中，待凈化。

1.4.2 凈化 吸取2 mL上清液加入至含200 mg PSA、100 mg C18粉末和200 mg無水硫酸鎂的15 mL塑料離心管中，渦旋混合2 min，4 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm有機濾膜，高效液相色譜—串聯(lián)/質(zhì)譜儀待測。

1.5 液相色譜參考條件的確定

對比不同的色譜柱與不同的有機相與水相溶液配比(見表1)，通過比較色譜行為，選擇合適的色譜柱和流動相。對梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，并設(shè)置和調(diào)節(jié)儀器的進(jìn)樣條件，以達(dá)到分離度高、峰型優(yōu)和響應(yīng)最佳的色譜行為，從而確定液相色譜條件。

1.6 質(zhì)譜參數(shù)條件的確定

1.6.1 分子離子峰的確定 配制一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用全自動進(jìn)樣，掃描范圍為200～300 Da，運用Q1 MSFull Scan模式正、負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，得到對應(yīng)的質(zhì)譜總離子流圖，并通過總離子流圖確定化合物的分子離子峰。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Liquid chromatography gradient elution procedure

1.6.2 二級質(zhì)譜掃描 選擇Product ion掃描模式，掃描范圍為50～300 Da，輸入分子離子質(zhì)核比數(shù)值，施加碰撞電壓進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描。

1.6.3 化合物質(zhì)譜條件的優(yōu)化 對目標(biāo)化合物質(zhì)譜條件的優(yōu)化項目包括電噴霧電壓、離子源溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、輔助氣壓力、去簇電壓、碰撞氣能量。選擇二級質(zhì)譜中相對響應(yīng)較高的子離子進(jìn)行MRM質(zhì)譜條件的優(yōu)化，記錄最優(yōu)的去簇電壓和碰撞氣能量，生成化合物質(zhì)譜條件。

1.7 提取條件和凈化方式的優(yōu)化

比較不同的有機試劑以及pH值對提取過程的影響，以提取效率為指標(biāo)，確定提取條件；對PSA、C18、MgSO4用量進(jìn)行正交試驗設(shè)計，以滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松含量的檢出值為參考指標(biāo)，通過極差分析確定最終優(yōu)化添加量，從而確定合適的凈化方式。

1.8 方法學(xué)驗證

1.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品的測定 取1.3.3中的混合標(biāo)準(zhǔn)系列對照品工作液，按優(yōu)化后液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄對應(yīng)定量離子的峰面積，以濃度對峰面積進(jìn)行繪制和擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。對于市售大米及面粉樣品，按1.4前處理后，經(jīng)液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測，以保留時間和相應(yīng)的定量、定性離子對定性，定量離子的峰面積外標(biāo)法定量。

1.8.2 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確度用樣品加標(biāo)回收率衡量，精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)表示。不同的基質(zhì)樣品進(jìn)行3個加標(biāo)濃度(低、中、高)的添加，分別測定回收率并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)(RSD%)。

1.8.3 最低定量限(LOQ) LOQ由10倍信噪比得出(S/N=10)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Analyst分析軟件采集，MultiQuant 定量軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)匯總后，采用Microsoft Office Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松的極性相對較弱，在普通C18色譜柱都能較好地保留。6-羥基滅草松和8羥基滅草松為同分異構(gòu)體，色譜柱以及流動相的選擇既要保證重疊峰有最佳分離度同時也要保證色譜峰的峰型及質(zhì)譜響應(yīng)，試驗選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，較Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)能達(dá)到更好的分離度。試驗表明，0.1%甲酸水—甲醇流動相體系不僅可以改善峰型，且在7 min內(nèi)可以達(dá)到較好的基線分離，更有利于化合物的定性和定量分析。故確定最優(yōu)色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度40 ℃；流動相A為0.1%甲酸—水溶液，B為甲醇，梯度洗脫；流動相流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。最優(yōu)色譜質(zhì)譜條件下各待測物質(zhì)的MRM色譜圖見圖2。由圖2可知，3種化合物峰型良好，分離度高，無干擾。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

試驗表明，ESI-模式下，3種化合物的分子離子[M-H]-均最為理想；然后分別以目標(biāo)化合物的 [M-H]-作為母離子，施加碰撞能量將其打碎，同時進(jìn)行子離子掃描，根據(jù)二級碎片離子掃描質(zhì)譜圖及可能的斷裂規(guī)律，選擇干擾較少、相對豐度較高的兩個子離子，并在負(fù)電離模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式優(yōu)化碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)，滅草松和6-羥基滅草松及8-羥基滅草松的二級質(zhì)譜圖見圖3。確定掃描方式為負(fù)離子掃描，氣簾氣壓力為275 kPa，電噴霧電壓為-4 500 V(負(fù)離子模式)，離子源溫度為450 ℃，霧化氣壓力為345 kPa，輔助氣壓力為380 kPa，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，相應(yīng)的質(zhì)譜條件見表2。

2.3 樣品提取溶劑優(yōu)化

農(nóng)藥殘留測定常用的萃取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等[19]。根據(jù)相似相溶原理，提取溶劑的極性和樣品基質(zhì)的類型決定目標(biāo)物質(zhì)的提取效率[20]。大米和面粉作為糧谷類產(chǎn)品進(jìn)行農(nóng)藥殘留測定前需先加入一定量的水進(jìn)行浸潤和溶脹，使提取試劑與樣品充分接觸互溶從而利于提取。試驗表明，甲醇提取液經(jīng)鹽析也無法與水相分離；丙酮與水互溶，加大后續(xù)提取液的凈化難度；正己烷和乙酸乙酯的提取率不高，故選擇乙腈作為提取液，加入無水硫酸鈉進(jìn)行鹽析。

圖2 滅草松及其代謝物的MRM色譜圖Figure 2 MRM chromatograms of bentazone,6-hydro- xymetazone,8-hydroxymetazone

圖3 滅草松及其代謝物的二級質(zhì)譜圖Figure 3 Secondary mass spectra of bentazone,6-hydroxymetazone,and 8-hydroxymetazone

表2 滅草松及其代謝物的質(zhì)譜條件?Table 2 The main reference mass spectrometry conditions of bentazone and its metabolites

滅草松及其代謝物的pKa值較小，降低溶液的pH值能有效地使目標(biāo)物由離子狀態(tài)轉(zhuǎn)為分子形式析出，從而使其在有機溶劑中的分配效率升高[21]。試驗采取直接加入酸的方式調(diào)節(jié)pH值，各目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率見表3。由表3可知，加酸后目標(biāo)化合物的回收率明顯高于未加酸的；加入鹽酸后的提取效果要明顯高于甲酸、乙酸等有機酸，且當(dāng)HCl添加量為0.5 mL時，滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松的回收率均高于其他添加情況。因此，提取過程中加入0.5 mL 6 mol/L的鹽酸溶液有助于提高提取率，從而提高過程回收率。

2.4 樣品凈化步驟優(yōu)化

研究[22]表明，石墨化碳黑粉、Al2O3粉對除草劑有較強的吸附，不建議作為凈化吸附劑。凈化小柱HLB按通用凈化過程，經(jīng)活化、上樣、淋洗、洗脫處理后，滅草松及其代謝物回收率均較低；直接提取后稀釋有基質(zhì)效應(yīng)且對儀器有一定程度損傷。故在最優(yōu)條件提取后的溶液中加入PSA、C18、MgSO4進(jìn)行凈化，綜合參照文獻(xiàn)[23-25]和國家標(biāo)準(zhǔn)[26-27]的通用用量添加，以滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松含量的檢出值為參考指標(biāo)設(shè)計正交試驗。正交試驗因素水平見表4，試驗結(jié)果見表5、6。

表3 酸添加量對滅草松及其代謝物提取率的影響Table 3 Effect of acid addition on the extraction rate of Bentazone and its metabolites

表4 正交試驗因素水平表Table 4 Factor level table of orthogonal test mg

由表6可知，滅草松的最優(yōu)凈化方式為PSA 300 mg、C18200 mg、MgSO4200 mg；6-羥基滅草松的最優(yōu)凈化方式為PSA 200 mg、C18100 mg、MgSO4200 mg；8-羥基滅草松的最優(yōu)凈化方式為PSA 200 mg、C18100 mg、MgSO4400 mg。當(dāng)PSA添加量分別為200，300 mg 時，滅草松含量無顯著差異；當(dāng)C18添加量分別為100，200 mg時，滅草松含量變化不顯著；MgSO4作為吸水劑，對滅草松及其代謝物含量影響不顯著。綜合考慮，選擇更少的添加量試劑：PSA 200 mg、C18100 mg、MgSO4200 mg。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

試驗使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比評估基質(zhì)效應(yīng)作用，即當(dāng)該比率為0.8～1.2時，為弱的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)該比率<0.8時，為基質(zhì)抑制作用；當(dāng)該比率>1.2時，為基質(zhì)增強作用[28]。由表7可知，滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值分別為1.06，1.42，1.82，說明滅草松具有較弱的基質(zhì)增強效應(yīng)，對結(jié)果的準(zhǔn)確性影響不大，而其代謝產(chǎn)物具有較強的基質(zhì)作用，即基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果產(chǎn)生的干擾較大。為了消除基質(zhì)增強效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，試驗擬使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方式進(jìn)行校準(zhǔn)，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

2.6 方法的線性范圍與檢出限

由表8可知，當(dāng)樣品濃度為0.1～100.0 μg/kg時，滅草松、6-羥基滅草松及8-羥基滅草松基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均>0.995，LOQ均能滿足GB 2763—2019中滅草松及其代謝物臨時限量檢測的要求。

表5 正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal test results

表6 極差分析Table 6 Range analysis of each parameter

表7 滅草松及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)Table 7 Matrix effects of Bentazone and its metabolites

表8 滅草松及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Table 8 Linear equation,correlation coefficient,linear range and limit of quantification of bentazone and its metabolites

2.7 方法的精密度與準(zhǔn)確度

由表9可知，滅草松、6-羥基滅草松及8-羥基滅草松的回收率為89.6%～106.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～11.7%，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合GB/T 27404—2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范，能夠滿足滅草松及其代謝物的殘留分析要求。

表9 大米和面粉中滅草松及其代謝物的加標(biāo)回收率及精密度Table 9 Recoveries rate and precision experiment (RSDs) of Bentazone and its metabolites in rice and flour (n=6)

2.8 實際樣品的測定

按試驗檢測方法對20批次武漢市各大農(nóng)貿(mào)市場的市售大米和面粉樣品進(jìn)行提取檢測。結(jié)果表明，各市售大米和面粉樣品均未檢出滅草松及其代謝物殘留。

3 結(jié)論

采用優(yōu)化的QuEChERS凈化方法，通過液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米和面粉中滅草松及其代謝物殘留量。結(jié)果表明，該檢測方法的可操作性強、步驟簡單快捷、色譜峰在7 min內(nèi)分離效果好，準(zhǔn)確度和精密度良好，能適用于實際樣品檢測，效果理想。滅草松及其代謝物在0.1～100.0 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法定量限為0.2 μg/kg，平均加標(biāo)回收率為89.6%～106.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～11.7%。試驗僅針對糧谷類基質(zhì)進(jìn)行了研究，對于油料作物和油脂等基質(zhì)相對復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)品的前處理方法也亟待開發(fā)。后續(xù)應(yīng)加大對不同種類、地域的農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測，完善其他不同種類基質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品檢測方法，為最大限量值地制定和法定標(biāo)準(zhǔn)方法的生成提供理論依據(jù)。