李佳楠 陳小華 郝 毫 劉 祥 張小鶯 陳 琛

(1.陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

桉油醇樟(Cinnamomumcamphoract.cineole)為樟科樟屬植物，原產(chǎn)于中國，大量產(chǎn)于馬達(dá)加斯加。樟屬植物揮發(fā)油可從葉、皮、果實(shí)中獲取，具有抗菌、抗炎和抗氧化作用[1-3]，可應(yīng)用于香料香精、食品保鮮和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域。目前，對樟屬植物揮發(fā)油化學(xué)成分和活性的分析研究主要集中于芳樟醇為主要成分的芳樟型和樟腦為主要成分的腦樟型方面，而有關(guān)1,8-桉葉油素為主要成分的油樟型的研究較少，主要集中在化學(xué)成分、抗氧化、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛和抗癌等活性方面，而酶抑制作用尚未見報道。

羅文莎葉揮發(fā)油是由桉油醇樟葉片經(jīng)水蒸氣蒸餾而得，被認(rèn)為是樟屬植物中最安全的精油品種，具有良好的抗菌、抗病毒和刺激免疫系統(tǒng)的作用[4]，適用于感冒、類感冒病毒感染癥，對病毒性肝炎和病毒性腸炎也有一定的治療效果[5]，也可用于改善呼吸道感染，如鼻竇炎和鼻喉黏膜炎及其并發(fā)癥[6-7]，還具有良好的袪痰效果。目前，羅文莎葉揮發(fā)油因其抗菌功效常被用作熏香來改善呼吸道不適，但有關(guān)羅文莎葉揮發(fā)油成分分析和生物活性的研究尚未見報道。

試驗(yàn)擬采用氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用法測定羅文莎葉揮發(fā)油的化學(xué)組成，通過紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法測定其抗菌活性，并測定其對胰脂肪酶α-葡萄糖苷酶兩種酶的抑制活性，旨在為羅文莎葉揮發(fā)油的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅文莎葉揮發(fā)油：產(chǎn)自云南昆明，廣州樂顏生物科技有限公司；

菌株(見表1)：大連理工大學(xué)生命科學(xué)院于海寧副教授提供；

α-葡萄糖苷酶：酶活≥100 U/mg，上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；

奧利司他(純度>98%)、阿卡波糖(純度>97%)：大連美倫生物技術(shù)有限公司；

表1 菌株列表Table 1 List of strains

4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，純度≥99%)、4-甲基傘形酮油酸酯(純度≥95%)：美國Sigma公司；

酵母浸粉、蛋白胨：英國OXOID公司；

瓊脂、胰脂肪酶：北京索來寶科技有限公司；

其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析級。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890B-7000D型，安捷倫科技有限公司；

全波長酶標(biāo)儀：Epoch2型，美國伯騰儀器有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：M200型，瑞士帝肯公司；

可見分光光度計(jì)：722G型，上海儀電分析儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：LXDL 18-20型，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50FBS型，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅文莎葉揮發(fā)油的提取 采用水蒸氣蒸餾法，其提取率為0.61 mL/100 g。

1.3.2 GC-MS分析

(1) 色譜條件：根據(jù)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行修改。色譜柱為Agilent DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，以4 ℃/min升溫至140 ℃，再以1 ℃/min 升溫至160 ℃，再以5 ℃/min升溫至210 ℃，保持30 min。載氣(高純氦)流速1.2 mL/min，壓力93.1 kPa，進(jìn)樣量2‰無水乙醇溶液1 μL。

(2) 質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；電子倍增電壓EMV 1 739.4 V；質(zhì)量掃描范圍m/z45～500。

(3) 定性及定量分析：揮發(fā)性成分定性分析采用NIST 17質(zhì)譜庫匹配分析鑒定，定量分析采用面積歸一化法計(jì)算相對百分含量。

1.3.3 抑菌活性測定

(1) 抑菌活性：采用紙片擴(kuò)散法。直徑6 mm的濾紙片滅菌后備用；將100 μL 106CFU/mL待測菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基；將濾紙片浸于揮發(fā)油后貼于含菌平板表面，用無菌水浸泡的濾紙片作空白對照，37 ℃培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑，進(jìn)行3個平行試驗(yàn)，取均值。

(2) 最小抑菌濃度：采用微量肉湯稀釋法。取羅文莎葉揮發(fā)油1 mL精密稱量后得其密度為0.814 2 g/mL。在無菌96孔板的第1孔中加入118 μL羅文莎葉揮發(fā)油與182 μL 106CFU/mL菌液，使第1孔中的揮發(fā)油濃度為320 mg/mL，向第2～12孔中分別加入150 μL菌液，將第1孔充分混勻后吸取150 μL加入第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，第12孔作為空白對照。將96孔板于37 ℃ 培養(yǎng)8～10 h，觀察孔內(nèi)細(xì)菌生長情況，沒有細(xì)菌生長(孔內(nèi)液體呈清亮狀態(tài))的孔的最小濃度即為最小抑菌濃度，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 酶抑制活性測定

(1) 胰脂肪酶抑制活性：根據(jù)文獻(xiàn)[9]進(jìn)行修改。用無水乙醇配制濃度為100，120，140，160，180 mg/mL的揮發(fā)油溶液；奧利司他用二甲基亞砜(DMSO)溶解，用Tris-HCl緩沖液稀釋至相同濃度梯度作為陽性對照；用Tris-HCl緩沖液配制0.5 mg/mL胰脂肪酶溶液。吸取25 μL揮發(fā)油溶液與25 μL胰脂肪酶溶液于96孔板中混勻，37 ℃孵育10 min，加入50 μL 0.5 mg/mL 4-甲基傘形酮油酸酯底物，37 ℃反應(yīng)30 min，采用多功能酶標(biāo)儀(Em/Ex=465/360)37 ℃下測定產(chǎn)物4-甲基傘形酮的熒光。按式(1)計(jì)算胰脂肪酶活性抑制率。

(1)

式中：

I——酶活抑制率，%；

A100——空白對照的值；

Ax——加入抑制劑的值；

A0——酶溶液的背景值；

Ax0——樣品的背景值。

(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性：根據(jù)文獻(xiàn)[10]進(jìn)行修改。用無水乙醇配制濃度為10，20，30，40，50 mg/mL的揮發(fā)油溶液；阿卡波糖用去離子水配制為相同濃度梯度作為陽性對照。所有試劑于37 ℃預(yù)熱15 min，取50 μL揮發(fā)油溶液于96孔板中，再加入50 μL 1 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液(溶解于PBS)，混勻，37 ℃孵育15 min，加入50 μL 5 mmol/Lα-pNPG溶液，37 ℃反應(yīng)30 min，測定405 nm處各孔的吸光度值。用PBS替代樣品為空白對照，用阿卡波糖作陽性對照。按式(1)計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各組成成分在NIST 17質(zhì)譜庫中匹配與分析，確定化合物種類，采用峰面積歸一法計(jì)算各組分相對含量。使用OriginPro 8.5、GraphPad Prism 8.0和Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS分析揮發(fā)油成分

由圖1、表2可知，羅文莎葉揮發(fā)油中共檢出17種成分，主要由醇類和萜烯類化合物組成，分別占揮發(fā)油總量的31.49%，31.35%。其次為含氧萜類和芳香烴類化合物，分別占揮發(fā)油總量的21.67%，10.14%。烯烴類和醚類化合物較少，分別占揮發(fā)油總量的2.41%，0.43%。其中，相對含量>10%的成分為桉葉油醇、樟腦、香樹烯和對傘花烴，其相對百分含量分別為30.89%，21.67%，12.38%，10.14%。相對含量>5%的成分為β-蒎烯和雙戊烯，分別為6.01%，5.15%。其余化合物含量相對較低，約為0.31%～2.65%。王進(jìn)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，樟樹葉揮發(fā)油中含量較高的為芳樟醇(32.40%)、對傘花烴(24.41%)、樟腦(19.60%)和桉葉油醇(18.75%)，與試驗(yàn)結(jié)果相比，羅文莎葉揮發(fā)油中無芳樟醇、桉葉油醇含量較高，樟腦含量相當(dāng)，對傘花烴含量較低，安全性較高。

2.2 抑菌作用

2.2.1 揮發(fā)油的抑菌活性 由表3可知，羅文莎葉揮發(fā)油對6種供試菌均有抑制作用，對G+菌(金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞腸球菌)的抑菌圈大小分別為11.8，10.6 mm；對G-菌(大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853)的抑菌圈大小分別為10.5，10.5 mm；對真菌(白色念珠菌ATCC10231、白色念珠菌臨床分離株)的抑菌圈大小分別為9.8，11.7 mm；說明羅文莎葉揮發(fā)油對G+菌、G-菌及真菌表現(xiàn)出良好的抑制效果，且對G+菌的抑制效果稍強(qiáng)于G-菌。

圖1 羅文莎葉揮發(fā)油成分總離子流圖Figure 1 GC-MS total ion current chromatogram of Ravansaravolatile oil

表2 羅文莎葉揮發(fā)油的化學(xué)成分和相對含量Table 2 Composition and relative content of Ravansaravolatile oil

表3 羅文莎葉揮發(fā)油對各種菌株的抑菌圈直徑Table 3 The diameter of the zone of inhibition of Ravansaravolatile oil on various strains mm

2.2.2 最小抑菌濃度 由表4可知，羅文莎葉揮發(fā)油對G-菌的MIC范圍為10～40 mg/mL，對痢疾桿菌的抑制效果最差，為40 mg/mL，對大腸桿菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌08031012、變形桿菌抑制效果較好，為10 mg/mL。羅文莎葉揮發(fā)油對G+菌的抑菌效果較G-菌稍強(qiáng)，MIC范圍為10～20 mg/mL，除對金黃色葡萄球菌ATCC27853抑制效果稍差(20 mg/mL)外，其余均為10 mg/mL。羅文莎葉揮發(fā)油對真菌的抑制效果最好，MIC范圍為1.25～20.00 mg/mL，抑菌效果最好的為灰團(tuán)網(wǎng)黏菌，MIC為1.25 mg/mL，對光滑念珠菌08A802、白色念珠菌08022710抑制效果稍差，為20 mg/mL。

表4 羅文莎葉揮發(fā)油對各菌株的最小抑菌濃度Table 4 The MIC of Ravansaravolatile oil on various strains

Bautista-Silva等[12]研究發(fā)現(xiàn)，姚金娘科白千層揮發(fā)油對11種細(xì)菌的MIC值范圍為7.8～62.5 mg/mL，因此羅文莎葉揮發(fā)油顯示出較強(qiáng)的抑菌效果。研究[13-14]表明，植物揮發(fā)油對G+菌的抑制效果強(qiáng)于G-菌，與試驗(yàn)結(jié)果一致，可能是G+菌細(xì)胞壁所含大量的肽聚糖被活性成分破壞導(dǎo)致的。此外，抑菌結(jié)果顯示羅文莎葉揮發(fā)油對真菌的抑制效果表現(xiàn)良好。羅文莎葉揮發(fā)油具有顯著的抑菌效果，可能是因?yàn)槠渲泻械妮祁?、醇類等化合?如樟腦、蒎烯、桉葉油醇等)的分子結(jié)構(gòu)特征與生物膜分子結(jié)構(gòu)特征相似，容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入菌體而發(fā)揮抑菌作用[15-18]。抑菌活性測定結(jié)果顯示羅文莎葉揮發(fā)油具有重要的藥學(xué)研究價值和作為天然食品抗菌劑和防腐劑的潛能[19]。

2.3 酶抑制活性

2.3.1 胰脂肪酶 目前被用作抗肥胖的藥物主要有奧利司他、氯卡色林、芬特明—托吡酯、納曲酮—安非他酮和利拉魯肽[20]，這些藥物可通過抑制胰脂肪酶活性、抑制食欲和促進(jìn)脂質(zhì)代謝發(fā)揮作用[21]，但會造成胃腸疾病、肝損傷、失眠心悸、口干、頭痛和高血壓等副作用[22]。由圖2可知，當(dāng)濃度為100 mg/mL時，羅文莎葉揮發(fā)油對胰脂肪酶的抑制率為84.50%，其抑制胰脂肪酶活性的IC50值為37.2 mg/mL。這種抑制作用可能是揮發(fā)油中含有大量的萜烯類成分尤其是單萜和倍半萜[23-25]。

2.3.2α-葡萄糖苷酶α-葡萄糖苷酶是糖類水解過程中重要的酶，阿卡波糖、伏格列波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥可通過抑制其活性降低餐后血糖，使胰島素敏感性提高[26]，達(dá)到一定的治療效果，但具有較嚴(yán)重的副作用[27]。研究[28-30]表明，許多植物中的化學(xué)成分可以治療Ⅱ型糖尿病。由圖3可知，當(dāng)濃度為100 mg/mL時，羅文莎葉揮發(fā)油對α-葡萄糖苷酶的抑制率為93.67%，IC50為6.81 mg/mL。這種抑制作用可能是由于羅文莎葉揮發(fā)油中存在大量倍半萜類[31]。Sriramavaratharajan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，樟屬植物肉桂葉揮發(fā)油的脂肪酶抑制活性的IC50值為838.46～923.17g/mL，α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值為56.65～536.70g/mL，較羅文莎葉揮發(fā)油的37.20，6.81 mg/mL高39，11倍以上，羅文莎葉揮發(fā)油對脂肪酶和α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性但較弱，可能是因?yàn)檎翆僦参锍煞旨皽y定方法的差異性。

圖2 羅文莎葉揮發(fā)油對胰脂肪酶活性抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of Ravansaravolatile oil on pancreatic lipase activity

圖3 羅文莎葉揮發(fā)油對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of Ravansaravolatile oil on α-glucosidase activity

3 結(jié)論

通過氣相色譜—質(zhì)譜法確定了羅文莎葉揮發(fā)油的17種化學(xué)成分，其主要成分為萜類、醇類、烷烴類等物質(zhì)。羅文莎葉揮發(fā)油對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌的抑制效果良好，對革蘭氏陽性菌的抑制效果稍強(qiáng)于革蘭氏陰性菌；對真菌的抑制作用較好，但作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究；該揮發(fā)油具有良好的抑菌防腐作用，在天然防腐劑領(lǐng)域有一定的應(yīng)用價值。該揮發(fā)油對脂肪酶、α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制效果，具備作為天然來源減肥藥和降糖藥的潛在價值，但效果不如常用藥物奧利司他和阿卡波糖。后續(xù)可進(jìn)一步篩選活性相關(guān)物質(zhì)，考慮其結(jié)構(gòu)修飾增強(qiáng)活性，并對作用機(jī)理進(jìn)行研究。