王金昌，靳 亮，占智高，況文東，關(guān)麗梅，陳俊輝

(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

水稻秸稈是世界上最豐富的木質(zhì)纖維廢棄物之一，年產(chǎn)量約7.31 億t[1]。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年各種農(nóng)作物秸稈資源量約7 億t(《中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒》編委會(huì)，2018年)，其中水稻秸稈產(chǎn)量達(dá)2.3 億t。由于水稻秸稈蛋白質(zhì)含量低、礦物質(zhì)含量高、土壤降解慢，常被作為燃料直接焚燒，不僅造成資源浪費(fèi)，而且會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。此外，水稻秸稈燃燒可減少土壤中的養(yǎng)分和微生物群[2]。水稻秸稈70%的干生物質(zhì)由多糖組成，是可發(fā)酵糖的豐富來(lái)源。因此，水稻秸稈是一種豐富的非糧食、未充分利用的資源。水稻秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3種成分組成，這3種成分通過(guò)不同程度結(jié)合在一起，由于其堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)使其降解難度增加，在自然降解的情況下非常困難[3]。工業(yè)上常采用高溫高壓或強(qiáng)堿進(jìn)行預(yù)處理，但這些措施需要消耗能量和會(huì)污染環(huán)境。利用微生物處理水稻秸稈便成為近年來(lái)人們研究的熱點(diǎn)。與物理、化學(xué)等方法處理相比，微生物降解法具有投資少、操作簡(jiǎn)單、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。

目前報(bào)道的能降解天然水稻秸稈主要是真菌，如多輪青霉、總狀枝毛霉和煙色曲霉[4]。尹璐研究了簡(jiǎn)青霉固態(tài)發(fā)酵對(duì)天然水稻秸稈降解效果和降解產(chǎn)物，但其發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，且發(fā)酵產(chǎn)物為長(zhǎng)鏈脂肪烴、脂肪酸、脂類和芳香酚類物質(zhì)[5]；賈金如利用粗糙脈孢菌Neurosporacrassa14-8和其他真菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵水稻秸稈產(chǎn)飼料蛋白[6]；Liu利用微生物群落MC1發(fā)酵降解水稻秸稈，所分析的15種有機(jī)物大部分屬于有機(jī)酸，但含量最高的化合物為乙酸乙酯，第4天達(dá)到13.56 g/L[7]；還有發(fā)酵水稻秸稈產(chǎn)氫[8]、產(chǎn)糖[9]、生物丁醇[10]、生物乙醇和沼氣的報(bào)道[11-12]。

利用微生物發(fā)酵水稻秸稈生產(chǎn)人類急需的燃料、飼料及化工產(chǎn)品，具有極其重要的意義和發(fā)展前景。微生物降解水稻秸稈酶活性高低決定了水稻秸稈被降解的程度和降解產(chǎn)物。從土壤中分離篩選到一株高效降解水稻秸稈的菌株草酸青霉(PenicilliumoxalicumT1)，可為水稻秸稈的資源化利用提供有效的菌種資源。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1 篩選培養(yǎng)基 CMC-Na 10 g、(NH4)2SO41.4 g、MgSO40.3 g、KH2PO42 g、MnSO41.6 mg、FeSO45 mg、ZnSO42.5 mg、CoCl22.0 mg、瓊脂20 g，pH7.0，定容1L。

1.1.2 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 CMC-Na 10 g、(NH4)2SO44.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO42 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g(pH自然, 定容到1L)。

1.1.3 水稻秸稈降解 Mandel′s無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液(NH4)2SO41.4 g、KH2PO42.0 g、尿素0.3 g、微量元素(MgSO4·7H2O 0.3 g、CaCl20.3 g、MnSO42.5 mg、FeSO4·7H2O 7.5 mg、ZnSO42.0 mg、CoCl20.3 g)，蒸餾水定容到1 L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 初篩方法 稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于搖床150 r/min振蕩30 min后取出，逐級(jí)稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的6種濃度，將6種濃度的稀釋液分別涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，于25 ℃培養(yǎng)3 d。待菌長(zhǎng)出后，再接種于新的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上純化，直至獲得純菌株為止。

1.2.2 復(fù)篩方法 將步驟1.2.1分離的單個(gè)菌株分別點(diǎn)種于CMC平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d，用1.0 g/L剛果紅染色30 min，傾去染液，再用1 mol/L的NaCl水溶液脫色1 h，測(cè)菌落直徑(d，cm)和水解圈直徑(D，cm)，采用Dp表示水解能力：Dp=(D/d)2。

1.2.3 菌株纖維素降解酶酶活測(cè)定 將復(fù)篩獲得的菌株按5%的接種量分別接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在搖床(25 ℃，150 r/min)培養(yǎng)3 d后，6 000 r/min離心10 min，取上清液即為制備的粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測(cè)定濾紙酶活性和內(nèi)切型葡萄糖苷酶活性，外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性[13]。

1.2.4 水稻秸稈降解實(shí)驗(yàn) 將水稻秸稈于80 ℃烘干至恒重后，截成長(zhǎng)度為 2～3 cm，分別稱取10 g的水稻秸稈于15個(gè)250 mL 錐形瓶，加入150 mL Mandel′s無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液121 ℃滅菌 30 min。將草原青霉菌接種于裝有2 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的試管中，28 ℃、200 r/min、48 h后全部接入錐形瓶中，28 ℃、200 r/min直至水稻秸稈被降解成湯，同時(shí)分別每間隔24 h分別取樣進(jìn)行固液分離，水稻秸稈殘?jiān)?0 ℃烘干至恒重后稱重，計(jì)算水稻秸稈降解率。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 篩選到一株具有纖維素降解能的Penicillium oxalicum T1

本課題組利用CMC-Na平板篩選到一株具有纖維素降解能力的真菌T1，菌落形態(tài)平坦，質(zhì)地絨狀，菌絲體初期為白色，后期變?yōu)榛揖G色，菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。提取T1基因組，用真菌引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后在NCBI上BLAST的結(jié)果為Penicilliumoxalicum，故命名為：PenicilliumoxalicumT1，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)：CCTCC M2019608。

圖1 T1菌落圖

2.2 Penicillium oxalicum T1纖維素降解酶酶活測(cè)定

PenicilliumoxalicumT1，水解圈見(jiàn)圖2，Dp=(D/d)2=4，表明其具有較好的纖維素降解能。采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測(cè)定其纖維素內(nèi)切酶酶活為78.68 U/mL，濾紙酶酶活為30 U/mL，外切酶酶活為22 U/mL，β-Gase為39 U/mL。

圖2 T1號(hào)菌株的透明水解圈

2.3 草酸青霉Penicillium oxalicum T1降解天然水稻秸稈

用Mandel′s無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，PenicilliumoxalicumT1在9 d內(nèi)能降解天然水稻秸稈成湯液，見(jiàn)圖3。

(左圖為對(duì)照，右圖為降解結(jié)果圖)

PenicilliumoxalicumT1在發(fā)酵降解水稻秸稈1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d和9 d后，水稻秸稈殘?jiān)芍胤謩e為：9.67 g、8.61 g、8.21 g、7.84 g、7.71 g、7.56 g、7.27 g、6.86 g和3.53 g，計(jì)算水稻秸稈降解率分別為：3.3%、13.9%、17.9%、21.6%、22.9%、24.4%、27.8%、31.4%和64.7%。水稻秸稈降解過(guò)程見(jiàn)圖3，草酸青霉對(duì)水稻秸稈降解能力很強(qiáng)，前2 d能迅速軟化水稻秸稈，隨后菌體大量增殖，同時(shí)緩緩降解水稻秸稈，到了第9天，迅速把水稻秸稈固體降解成湯液，效果見(jiàn)圖4。

圖4 Penicillium oxalicum T1降解水稻秸稈效果圖

張冬雪篩選的菌株P(guān)enicilliumoxalicumWAF6 對(duì)水稻秸稈的降解率為45.72%；CMCase 活力在培養(yǎng)的第5天達(dá)到最大值29.35 U/mL[14]。穆春雷從玉米秸稈還田地區(qū)篩選出1株草酸青霉菌，能夠在低溫下高效降解纖維素，在搖床發(fā)酵培養(yǎng)第9天時(shí)，CMCase活力最高，達(dá)33.08 U/mL[15]。王洪媛等所篩選的Penicilliumoxalicum98MJ在培養(yǎng)5 d后，其對(duì)由小麥秸稈制備的秸稈木質(zhì)纖維素的降解率為26.8%[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PenicilliumoxalicumT1纖維素酶活高于已報(bào)道的菌株。

3 結(jié)論

從土壤樣品中分離得到具有纖維素酶的真菌PenicilliumoxalicumT1，其纖維素內(nèi)切酶酶活為78.68 U/mL，濾紙酶酶活為30 U/mL，外切酶酶活為22 U/mL，β-Gase為39 U/mL。當(dāng)水稻秸稈做為碳源，利用Mandel′s無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液，菌株在9 d內(nèi)能降解天然水稻秸稈成湯液，對(duì)水稻秸稈降解率達(dá)64.7%，高于已報(bào)道的菌株，是一株十分具有研究開(kāi)發(fā)潛力的纖維素酶生產(chǎn)菌株。