宗亞倩 ，吳曉祥，李 榮，馬慶兵，段新慧，姜 華

(1.云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省草山飼料工作站，云南 昆明 650225；3.云南尋甸黑頸鶴省級自然保護區(qū)管護局，云南 尋甸 655200)

光葉紫花苕(Vicia villosaRoth var.glabrescens)為豆科野豌豆屬(Vicia) 一年生或多年生自花傳粉的二倍體植物，是中國重要的豆科牧草之一[1]。它是富含蛋白質、氨基酸和無機鹽的飼用綠肥及倒茬作物，既可固氮增加土壤肥力，又能提高其他茬口作物的產量，在農業(yè)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中扮演著十分重要的角色[2]。光葉紫花苕在云南具有較大的種植面積，因其根系深長，營養(yǎng)價值高，既可作為綠肥作物又能喂養(yǎng)家畜，特別是與其他禾本科植物混合調制的干草不僅可以充分保留青干草中粗蛋白含量，而且還能解決冬春季節(jié)牧草不足的問題[3]。

染色體是細胞內具有遺傳性質的物質，是遺傳信息的載體。染色體的數量、大小和特征等差異是研究物種進化的重要依據，因此進行染色體核型分析，是牧草種質資源研究的重要工作，在鑒定親緣關系及判定變異程度上具有重要意義[4-5]。野豌豆屬中大部分植物為優(yōu)質牧草和綠肥植物，經濟價值較高，全世界約150 種[6]，染色體的數目和結構變化較多，數目有2n=10、12、14、24 和28 等，其染色體基數分別為n=5、6、7、9 和11等[7]。目前國內外學者已在窄葉野豌豆(Vicia angustifolia)、箭筈豌豆(Vicia sativa)、廣布野豌豆(Vicia cracca)、山野豌豆(Vicia amoena)、多莖野豌豆(Vicia multicaulis)、歪頭菜(Vicia unijuga)、四籽野豌豆(Vicia tetrasperma)及毛苕子(Vicia villosa)等[8-15]多種野豌豆屬植物中開展過染色體核型研究，但對光葉紫花苕核型分析的研究卻較少，僅見冉雪琴等[16]的報道，認為光葉紫花苕染色體核型多數由近中部著絲點(sm) 構成。為了能夠進一步探究光葉紫花苕核型的變化，本研究分析了光葉紫花苕的體細胞染色體數目、染色體相對長度、相對長度系數和臂比，從細胞學水平對光葉紫花苕的遺傳背景進行研究，以期為揭示野豌豆屬的染色體進化規(guī)律提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以云光早光葉紫花苕為研究材料，選取外觀完好、活力高、無病蟲害且大小均勻的種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體制片方法

將清選好的種子放入蒸餾水中，室溫下浸泡24 h 后，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫下培養(yǎng)，待幼根長至2～3 mm (豆科牧草種子發(fā)芽時有下胚軸伸長的習性，以上長度不包括下胚軸長度) 時，在9：00—11：00 選取材料；將選取的根尖放入二氯苯和8-羥基喹啉的混合液中，在15 ℃處理3～4 h，蒸餾水多次沖洗后，轉入卡諾氏固定液中固定24 h；再用蒸餾水將材料沖洗干凈，在1 mol/L 鹽酸溶液中于60 ℃水浴解離14 min。用卡寶品紅溶液和45%醋酸染色30 min，壓片制成臨時片，并觀察染色體，對分裂中期的細胞染色體進行觀察。選取清晰的50 個細胞進行計數和觀察，明確染色體條數；制成的永久片在顯微鏡下進行觀測并記錄染色體的長度。

1.2.2 染色體核型分析

核型分析標準：按李懋學等[17]、LEVAN 等[18]和STEBBINS[19]的標準進行染色體分類，按KUO等[20]提出的公式進行染色體相對長度系數的計算，最后根據染色體相對長度系數的大小，將其分為4 種類型：染色體相對長度系數≥1.26 的為長染色體(L)；1.25～1.01 的為中長染色體(M2)；1.00～0.75 的為中短染色體(M1)，染色體相對長度系數≤0.75 的為短染色體(S)。染色體臂比1.0～1.7 的為中部著絲點，以m 表示；1.7～3.0 的為近中部著絲點，以sm 表示；3.0～7.0 的為近端部著絲點，以st 表示；7.0 以上的為端部著絲點，以t 表示。

染色體相對長度=每條染色體長度/染色體組總長度×100%；

染色體相對長度系數=染色體長度/最短染色體長度；

染色體臂比=長臂長度/短臂長度；

核型不對稱系數=染色體長臂總長/全組染色體總長×100%。

1.3 數據統(tǒng)計與分析

試驗數據采用SPASS 18.0 進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差(one-way ANOVA)分析方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 核型分析

對光葉紫花苕進行了染色體計數及核型分析。染色體計數結果表明：光葉紫花苕的染色體數目均為14 條，染色體配對數為7，未見隨體，且各組同源染色體按照長度從大到小的順序配對方式見圖1。

圖1 光葉紫花苕同源染色體組配對圖Fig.1 V.villosa var.glabrescens homologous chromosomal group pairing diagram

2.2 染色體參數分析

對50 個根尖細胞進行觀察發(fā)現(xiàn)，染色體數目為2n=14 的細胞有43 個，占整體的86.0%。對5 個細胞(來源于不同個體)的測量和統(tǒng)計(表1)，光葉紫花苕染色體相對長度變異范圍在6.8～19.3，最長染色體是最短染色體長度的3.2 倍；相對長度系數范圍在0.48～1.35，光葉紫花苕的相對長度系數同源組間標準差為0.349。

表1 光葉紫花苕染色體參數分析Tab.1 Analysis of chromosome parameters of V.villosa var.glabrescens

在光葉紫花苕的同源染色體組中，第1、2 號染色體為長染色體，第3、4 號染色體為中長染色體，第5 號染色體為中短染色體，第6、7 號為短染色體，相對長度組成為2n=14=4L+4M2+2M1+4S。

2.3 同源染色體長度比及類型分析

通過對細胞染色體分散較好、較清晰的片子進行測量以及染色體組型分析。由表2 可知：光葉紫花苕同源染色體組染色體臂比均在1.0～1.7之間，臂比值變化范圍為1.07～1.50，光葉紫花苕7 對染色體全為中部著絲點 (m)。

表2 同源染色體臂比及類型分析Tab.2 Analysis of homologous chromosome length ratio and type

綜合表1、2 中染色體長度和臂比均值，根據STEBBINS[19]的核型分析方法計算得出染色體長度比為3.2，屬于“B”型染色體，臂比值范圍為1.07～1.50，沒有臂比值大于2∶1 的染色體，核型不對稱系數為55.9%，所以染色體類型為“1B”型。

3 討論

核型分析是指為闡明生物染色體組成，確定其染色體組型，從而根據材料的染色體數目、大小、著絲粒位置、臂比和隨體等形態(tài)特征對生物染色體進行配對和分組等分析[21]。核型分析技術區(qū)別于傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別，主要是在細胞水平上研究染色體特征，并以此為依據對植物進行分類，這樣會使結果更加真實準確，對于植物分類、演化過程以及種屬間親緣關系的分析等具有重要作用[22]。通過分析染色體形態(tài)、數目及結構差異，為物種之間的遺傳距離、進化和親緣關系在細胞學水平上提供了理論依據[2]。

研究表明：野豌豆屬植物的染色體一般由3種染色體構成，分別是中部著絲點染色體m、近中部著絲點染色體sm 和近端部著絲點染色體st，其中近中部著絲點染色體sm 和近端部著絲點染色體st 是由中部著絲點染色體m 進化而來的，且數目上由2n=14→2n=12 的方向進行演化[6-8]。本試驗中云光早光葉紫花苕的染色體數目為2n=14，染色體基數為x=7，7 對染色體的著絲點均為中部著絲粒m，染色體組的染色體長度比為3.20，臂比值＞2 的染色體的占比為0.0%，核型不對稱系數為55.9%，核型不對稱性標準應為1B。因此云光早光葉紫花苕的核型公式為2n=14=14m (1B)，說明該供試材料屬于進化程度較低、較原始的類群。雖然云光早光葉紫花苕的染色體數目與冉雪琴等[16]研究的貴州光葉紫花苕、楊根鳳等[15]研究的內蒙古毛苕子的染色體數目相同都為14 條，但核型卻存在顯著差異。貴州光葉紫花苕核型公式是2n=14=4m (2SAT)+10sm，第7 對染色體有隨體；內蒙古毛苕子的核型公式是2n=14=8m (2SAT)+6sm，第3 對染色體有隨體；而本研究中云光早光葉紫花苕核型公式是2n=14=14m，無隨體。本研究中光葉紫花苕的核型結構與前人研究有所差異的原因可能是由以下3 個方面造成的。一是由于細胞內染色體結構變異，造成染色體的配對和排列不同；二是由于自然環(huán)境不同，為了適應不同的生長環(huán)境核型發(fā)生了變化；三是由于在試驗過程中三者設定的預處理時間、解離時間及試劑不同造成的。且本試驗中云光早光葉紫花苕染色體無隨體，可能由于隨體太小未發(fā)現(xiàn)，也有可能是在制片過程中造成丟失，具體原因仍需進一步綜合分析。

4 結論

云光早光葉紫花苕是染色體數目為2n=2x=14 的二倍體植物，其核型公式為2n=14=14m，染色體類型為“1B”型，臂比指數主要集中在中部著絲粒m。從核型不對稱程度和染色體大小可得出云光早光葉紫花苕屬于進化上較為原始的種類。