楊潤(rùn)煥 ，畢峻龍,2，趙 謙，劉 霄，楊貴樹，尹革芬

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 楚雄 675000)

豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC) 是由潛在的原發(fā)病原和繼發(fā)病原，以及環(huán)境應(yīng)激、不良的飼養(yǎng)管理和豬體免疫力降低等因素相互作用引起的疫病[1]，PRDC 是引發(fā)豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一[2]，引起PRDC 的主要病原有豬偽狂犬病病毒(PRV)[2]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)[3]、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)[4-5]、豬肺炎支原體(MH)[6]、傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)[7]和副豬嗜血桿菌(HPS)[8]等。在規(guī)?；i場(chǎng)養(yǎng)殖過程中，PRDC 由多種病原混合感染引起，常見以病毒的、細(xì)菌的、病毒與細(xì)菌間多種組合的多重混合感染的形式出現(xiàn)。據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，PRRSV和PCV2 混合感染較為常見[9]，對(duì)PRDC 發(fā)生起著不可忽視的影響。

為調(diào)查2016—2017 年云南省規(guī)模化豬場(chǎng)及散養(yǎng)戶間PRDC 主要病原的感染狀況，本研究對(duì)云南省16 個(gè)縣市送檢的406 份疑似PRDC 病料，通過PCR 或RT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，從而為有效防控地方PRDC 提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料信息

本研究所用樣品來自云南省16 個(gè)縣市送檢的疑似PRDC 病料，主要采集于咳嗽、呼吸困難和體溫升高等疑似PRDC 發(fā)病豬的肺、腎和淋巴結(jié)等組織病料和血液，2016 和2017 年分別送檢樣品113 和293 份，合計(jì)406 份。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus Total RNA、1 000 DNA Marker、6×Loading Buffer 購(gòu)自大連Takara 公司；細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；EasyScript RT/RI Enzyme Mix、2×ES Reaction Mix、2×TransTaqHiFiSuper MixⅡ購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DEPC (分析純)、異丙醇、氯仿和無水乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EasyScript RT/RI Enzyme Mix、瓊脂糖購(gòu)自白賽勤化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 引物

引物參考NCBI 上公布的相關(guān)基因組序列，利用Primer 6.0 在其保守序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

1.4 DNA 提取及PCV-2、PRV、MH、HPS 和APP 的PCR 檢測(cè)

將樣品進(jìn)行研磨、離心等處理后，使用DNA 提取試劑盒提取DNA，按照相關(guān)說明書進(jìn)行。將提取的樣品DNA 利用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，方法參照文獻(xiàn)[10]并加以改進(jìn)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min；4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后取10 μL 產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2% EB）電泳30 min 保持電壓120 V，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.5 RNA 提取及CSFV、PRRSV 檢測(cè)

將樣品進(jìn)行研磨、離心等處理，在裝有200 μL 樣品的離心管中加入1 000 μL TRIzol 細(xì)胞裂解液，4 ℃靜置10 min，10 000 r/min 離心10 min；取上清后，往上清中加入一半體積的氯仿，4 ℃靜置10 min，10 000 r/min 離心10 min；取上清后加入等體積異丙醇，4 ℃靜置10 min，10 000 r/min 離心10 min；棄去管中液體后往管中加入1 000 μL 75%乙醇，10 000 r/min 離心5 min。室溫放置5～10 min，最后溶于20 μL 無RNA 酶水中，立刻進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。CSFV 采用巢氏PCR 進(jìn)行檢測(cè)，PRRSV 檢測(cè)為普通PCR。CSFV 第1 輪擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)34 次；72 ℃后延伸5 min；4 ℃保存。將第1 輪PCR 產(chǎn)物稀釋300 倍用于第2 輪擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃40 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)34 次；72 ℃后延伸5 min；4 ℃保存。PRRSV 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃30 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)34 次；72 ℃后延伸5 min；4 ℃保存。取10 μL 產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.2% EB)電泳30 min，保持電壓120 V，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRDC 檢測(cè)

結(jié)果(圖1、2) 表明：PCR 擴(kuò)增的電泳條帶與預(yù)期條帶大小基本相符。

2.2 送檢樣品病原陽性率

對(duì)于單一感染而言，云南省2016—2017 年病毒性病原中PCV2 總陽性率最高為59.00%，其次是PRRSV，總陽性率為35.79%；細(xì)菌性病原中MH 總陽性率最高為28.57%，APP 總陽性率最低為9.09%。2017 年CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、MH 和APP 感染較2016 年感染率上升；HPS 較2016 年感染率下降；PRV 在2016 年感染率最低，但仍有檢出，檢出率為1.11% (表2)。

圖1 PCR 擴(kuò)增HPS、PRV、PRRSV 和CSFV 結(jié)果Fig.1 The image of PCR amplification of HPS,PRV,PRRSV and CSFV

2.3 送檢樣品混合感染情況

在檢測(cè)到的陽性樣品中，混合感染情況表現(xiàn)復(fù)雜，以二重感染最為普遍，以PCV2+PRRSV感染率最高，為9.19%；其次是CSFV+PRRSV，為4.46%，PRRSV+PRV 和PCV2+MH 感染率最低，都為0.56%；調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)了三重和五重混合感染，其中三重感染PCV2+CSFV+PRRSV 感染率最高(2.51%)，PCV2+PRRSV+PRV 感染率最低(0.28%)，五重感染CSFV+PRRSV+PCV2+APP+HPS 為0.28%；未發(fā)現(xiàn)四重感染(表3)。

2.4 2016—2017 云南省16 個(gè)縣市PRDC 感染情況

PRDC 在云南省各地州的流行普遍存在，2016—2017 年CSFV 和PRRSV 陽性率都以祿豐最高，分別為80.00% 和83.33%；PCV2 陽性率以昆明最高，達(dá)90.00%；MH 和APP 陽性率以安寧最高，分別為60.00%和42.86%；HPS 陽性率以曲靖最高，為50.00%；PRV 陽性率以大理最高，為33.33% (表4)。

3 討論

圖2 PCR 擴(kuò)增APP、MH 和PCV2 結(jié)果Fig.2 The image of PCR amplification of APP,MH and PCV2

表2 2016—2017 送檢樣品病原陽性率Tab.2 The positive rates for individual pathogen from 2016 to 2017 %

表3 2016—2017 送檢樣品混合感染情況Tab.3 The occurrences of multiple co-infections for individual pathogen from 2016 to 2017

表4 2016—2017 年云南省各縣市送檢樣品病原的陽性率Tab.4 The positive rates for each pathogen from 2016 to 2017 from 16 cities/counties in Yunnan Province %

豬呼吸道病綜合征先后在北美和歐洲流行[11]，該疫病往往不是由一種病原體感染所致，而是由多種病原體混合感染引起；一類是潛在的原發(fā)性病原，主要為病毒；另一類是繼發(fā)性病原，繼發(fā)性病原是導(dǎo)致病豬大量死亡的主要原因[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期做了大量調(diào)查，宋春蓮等[13]調(diào)查發(fā)現(xiàn)：云南省2012—2016 年P(guān)CV2 陽性率最高，為40.25%。而來自北京、河北、廣東、浙江等省(市)的265 份疑似樣本中，PCV2 陽性率為16.6%，PCV3 陽性率為14.7%，二者混合感染率為6.8%[14]，有時(shí)混合感染率高達(dá)15.8%[15]、42.9%[16]。2016—2017 年，云南省以PCV2 陽性率最高，為59.00%，其次是PRRSV，為35.79%；與河北、浙江等省前期數(shù)據(jù)相比，二者陽性率大大升高，主要原因是PCV2 能侵害豬免疫系統(tǒng)，造成豬免疫系統(tǒng)的抑制，使豬的抗病能力明顯減弱，同時(shí)流行毒株進(jìn)化速度快，變異性強(qiáng)，從而PCV2 流行更廣[17-20]。2017 年CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、MH 和APP 感染較2016 年感染率上升，說明近年P(guān)RDC 病例顯著上升，防控形式加劇。對(duì)APP、MH 和HPS 3 種細(xì)菌性病原進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示：MH 感染陽性率最高，為28.57%；MH 是目前全球各地豬群中最常見的傳染性呼吸系統(tǒng)疾病之一，是主要的繼發(fā)性病原，PCV2 入侵后免疫力大幅度下降使得其余病原體更易入侵機(jī)體，造成感染率迅速上升[21]。同時(shí)APP 和HPS也是誘發(fā)豬呼吸道疾病的另一重要因素，而且常與免疫抑制性病原混合感染[22]。

隨著現(xiàn)代化養(yǎng)豬水平的逐步提高，豬呼吸道疾病綜合征在臨床癥狀表現(xiàn)方面出現(xiàn)了新變化，亞臨床和隱性感染病例顯著上升，多種病原混合感染已成為普遍現(xiàn)象，病豬的臨床癥狀與病理變化也變得愈加復(fù)雜[23]。劉曉東等[24]報(bào)道了多重感染的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)CSFV 與PRRSV(5/106)、CSFV 與PCV2 (1/106)、CSFV 與PCV3(5/106)、PRRSV 與PCV2 (9/106)、PCV2 與PRV(4/106)、PCV2 與PCV3 (3/106) 6 種類型的二重感染，CSFV+PRRSV+PCV2 (4/106)、CSFV+PRRSV+PRV (1/106)、CSFV+PRRSV+PCV3 (1/106)、CSFV+PCV2+PCV3 (3/106) 4 種類型的三重感染，比例都不高。云南省PRDC 豬群中混合感染以PCV2+PRV 最為常見[25]，宋春蓮等[13]調(diào)查發(fā)現(xiàn)：二重感染中，以PRRSV+PCV2 感染數(shù)最多，陽性率為6.32%；CSFV+PRV 最少，為0.62%；三重感染較少，CFSV+PRV+PVC2、PRRSV+PRV+PCV2 陽性率分別為0.71% 和0.68%，無四重感染；在本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)在二重感染中，以PCV2+PRRSV 混合感染最為突出，感染率為9.19%。在各縣市中，CSFV 和PRRSV 陽性率以祿豐的最高，PCV2 以昆明最高，MH 和APP 以安寧最高，HPS 以曲靖最高，PRV 以大理最高，呈現(xiàn)較為復(fù)雜的感染狀況。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于PRRSV 和PCV2 均有免疫抑制性，是作為云南省內(nèi)各個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶的豬呼吸道疾病感染的主要病原，它與細(xì)菌性或病毒性病原共同作用，發(fā)生繼發(fā)感染、多重混合感染的推動(dòng)因素著實(shí)不可小覷[26]。因此，在規(guī)?；i場(chǎng)疫病防控過程中需要對(duì)PRRSV 和PCV2 兩種病毒加以足夠重視，首要圍繞這兩種病毒進(jìn)行有效防控。另外，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)有1 份病料為CSFV+PRRSV+PCV2+APP+HPS 五重混合感染，陽性率為0.28%，目前未見有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，更值得關(guān)注和重視。

4 結(jié)論

PRDC 在云南省各州市普遍流行，以多種病毒性疾病和細(xì)菌性疾病混合存在，在當(dāng)前豬病防控的嚴(yán)峻形勢(shì)下，有必要加強(qiáng)對(duì)豬群的疫病監(jiān)測(cè)和疫苗使用。