張小紅 陶紅，3 王亞娟 李一春 張銳

（1. 寧夏大學資源環(huán)境學院，銀川 750021；2. 寧夏大學經(jīng)濟管理學院，銀川 750021；3. 寧夏（中阿）旱區(qū)資源評價與環(huán)境調控重點實驗室，銀川 750021）

鄰苯二甲酸酯（Phthalates esters，PAEs）又稱酞酸酯，是鄰苯二甲酸與醇形成的酯類，難溶于水，易溶于有機溶劑，主要作為增塑劑被廣泛應用于地膜、棚膜生產中［1-3］。PAEs與分子間以范德華力或氫鍵鏈接，彼此保留相對獨立的化學性質，使其在生產或排放過程中極易析出，污染空氣［4］、水體［5-7］、土壤［8-12］、降塵［13-14］等。由于鄰苯二甲酸酯在土壤中難以降解，它往往通過食物鏈進入到人體，在人體內不斷積累，進而危害人體健康。

PAEs降解途徑主要包括水解［15］、光解［16-18］、生物降解［19-21］等，由于生物修復具有高效、價廉、穩(wěn)定、安全等特點，從而被認為是降解土壤環(huán)境中PAEs最佳途徑，也因此成為近年來眾多學者研究的熱點。目前已篩選出降解環(huán)境中PAEs的降解菌有80多種［22］，如梁浩花等［23］從土壤中篩選出一株同時降解鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl ortho-phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（Di-n-butyl orthophthalate，DnBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯［Bis（2-ethylhexyl）ortho-phthalate，DEHP］的節(jié)桿菌屬，在最優(yōu)條件下其降解率分別可達99.62%、99.65%和55.26%；范新會［24］從土壤中篩選出一株降解DEHP的Arthrobacter菌，在84 h后，降解率可達97%以上；楊婕等［25］從土壤中篩選出一株降解DnBP的寡養(yǎng)單胞菌，在最優(yōu)條件下，降解率可達95.8%；王嘉翼［26］從長期受污染的土壤中篩選出一株降解DnBP的黃色桿菌屬，在最優(yōu)條件下，5 d后可降解完全等。

游離狀態(tài)降解菌的活性易受外界環(huán)境中溫度、pH、重金屬、鹽等的影響，而微生物固定化技術能有效起到保護降解菌的作用，減少外界環(huán)境的影響。1959年，Hattori等［27］成為第一批將大腸桿菌成功固定化的人，自此微生物固定化技術發(fā)展速度日益加快，到目前為止已形成較完備的理論和方法。Karamanev等［28］提出了土壤微生物固定化概念，證明了固定化可以有效提高微生物降解土壤持久性污染物的效率。Kadakol等［29］對游離和固定化微生物的研究表明固定化細胞更具優(yōu)勢。Ramakrishna等［30］對枯草芽孢桿菌細胞采用了海藻酸鈣固定，研究顯示該固定化細胞在發(fā)酵產酶10次后的酶活都在250 U左右。在國內，固定化微生物技術已經(jīng)在修復土壤農藥、石油及多環(huán)芳烴污染等領域開展了部分研究工作。陸佳靚［31］用包埋后的蠟狀芽孢桿菌和芽胞桿菌降解土壤中的毒死蜱和克百威，發(fā)現(xiàn)固定化后的菌種對毒死蜱和克百威的降解率超過了80%，高于游離菌的降解率，在很大程度上縮短半衰期的時間。元妙新［32］利用聚乙烯醇和海藻酸鈉包埋芽孢桿菌和動膠桿菌，降解土壤中的多環(huán)芳烴，研究表明在96 h時對芘降解率達到61.8%。在石油污染方面，胡文穩(wěn)、呂吉利和孫國強［33-35］分別采用海藻酸鈉包埋法、納米多孔SiO2載體吸附法和松針碳載體吸附法，對棒狀桿菌等進行包埋或吸附，研究表明固定化后的菌種降解效果更好。段淑偉［36］利用海藻酸鈉、膨潤土和殼聚糖對微生物進行包埋固定降解土壤中的DnBP，在第14、28 天時土壤中的DnBP殘留量分別高于66%和低于20%。周震峰等［37］利用海藻酸鈉（Sodium alginate，SA）和聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）對微生物進行包埋同樣發(fā)現(xiàn)固定化微生物對DnBP具有高效的降解能力。以上研究雖然表明固定化后微生物對于目標污染物的降解效率提高，但均為在實驗室控制條件，而對于固定化后微生物是否適應外界環(huán)境、能否在實際環(huán)境中保持高效降解能力涉及較少。

本研究以海藻酸鈉為載體，對課題組前期篩選出能同時降解DMP、DnBP和DEHP的優(yōu)勢菌株（微小桿菌）采用包埋法進行固定，形成固定化微球，比較固定化微球和游離菌降解土壤中DMP、DnBP和DEHP的效果及外界環(huán)境對其降解效果的影響，以期為本區(qū)域土壤鄰苯二甲酸酯污染修復及降解菌固定化的實際應用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為課題組前期分離鑒定保存的DMP、DnBP、DEHP高效降解菌：微小桿菌（Microbacteriumsp.），登錄號為：MG569788。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）配制：5.0 g氯化鈉，10.0 g蛋白胨，3.0 g牛肉膏于燒杯中，加水定容至1000 mL，分裝于5個250 mL錐形瓶中，用錫箔紙封口，1×105Pa滅菌30 min后使用。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基）配制：在5個250 mL的錐形瓶中均加入3.0-4.0 g的瓊脂，倒入200 mL LB液體培養(yǎng)基溶液，搖勻后用錫箔紙封口于1×105Pa滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃時倒平板。平板時培養(yǎng)基溫度盡量不要太高以免冷卻后上蓋凝結的冷凝水污染平板。

1.2 方法

1.2.1 游離菌的制備方法 在無菌操作臺上，挑取適量活化后的菌株到LB液體培養(yǎng)基，在175 r/min、30℃恒溫震蕩24-48 h，待肉眼觀看到培養(yǎng)液渾濁（即游離菌處于對數(shù)生長期）取出，然后將培養(yǎng)液分裝于50 mL已滅菌的離心管中，在室溫條件下以4000 r/min的速度離15 min后，丟棄上清液，用滅菌后的0.9%的生理鹽水洗滌濕菌體表面3次，收集該濕菌體。用生理鹽水將其調成菌懸液，在波長λ為600 nm條件下吸光度值達到1.003，制得菌懸液，用鋁箔紙封口后置于冰箱4℃保存?zhèn)溆茫▓D1-A）。

1.2.2 固定化微球的制備方法 稱取海藻酸鈉30 g于1000 mL燒杯中，加入750 mL蒸餾水攪拌至海藻酸鈉徹底溶解后，加入20 g活性炭，混勻封口。另稱取25 g氯化鈣溶于1000 mL水中并封口。將以上兩個混合液放入高壓滅菌鍋中進行滅菌處理（121℃，30 min）［38］，滅菌完成后，取出以上兩個混合液，等其冷卻后，向海藻酸鈉混合液中加入200 mL菌懸液（1.2.1）?；旌暇鶆蚝螅瑢缇鹉z管插入到該混合液中，在蠕動泵作用下將其緩緩滴入CaCl2溶液中，調整合適的高度使滴出的球盡量圓滑，得到固定化微球。將固定化微球在CaCl2溶液中放置18-24 h后，用滅菌過的蒸餾水沖洗干凈，保存在錐形瓶中封口后置于冰箱備用（圖1-B）。

圖1 鄰苯二甲酸酯菌懸液及固定化微球

1.2.3 游離菌和固定化微球降解土壤中DMP、DnBP和DEHP的效果 原土采自寧夏大學校園綠化土壤，去除石頭和草根等雜物，攪拌均勻后利用四分法得到1/4土壤原樣，在避光陰涼干燥處自然風干。風干后的土壤研磨后過20目篩，混合均勻。將經(jīng)過以上處理得到的土樣高壓蒸汽滅菌（121℃，1×105Pa，30 min），添加DMP、DBP和DEHP母液，使得最終污染后的土壤中DMP、DnBP和DEHP的濃度分別達到100 mg/kg、100 mg/kg和20 mg/kg。

取3份500 g污染土開展對照試驗。游離菌組：一份土樣中加入50 mL（1.2.1）菌懸液（接種量10%）。固定化微球組：一份土樣加入250 g固定化微球（1.2.2），以確保二者最終菌量一樣；空白對照組：兩者都不加入。用玻璃棒分別將3組土樣混勻后，置于不銹鋼托盤中并鋪平，加入一定量滅菌蒸餾水，30℃下于恒溫生化培養(yǎng)，保持3組對照土壤的水分含量符合田間最大持水量60%的要求。分別在第0、3、5、7、10、15和20 d時，將土樣均勻混合后四分法取部分土樣待處理。

1.2.4 環(huán)境條件對游離菌和固定化微球降解效果影響 配制DMP、DnBP和DEHP濃度均為50 mg/L的無機鹽培養(yǎng)液，分別設置不同環(huán)境條件，每個環(huán)境條件下分別添加游離菌和固定化微球（菌液接種量均為10%），同時設置未投加菌液和微球的空白對照，每個處理設置3個重復。在30℃、175 r/min避光條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測定DMP、DnBP和DEHP殘留量并計算降解率。

（1）pH設置5、7、9、11；（2）溫度設置4、10、20、30、40℃；（3）重金屬實驗組加入250 mg/L Cr、50 mg/L Pb、100 mg/L Cu、0.4 mg/L Cd，對照組不加重金屬；（4）無機鹽對照組為正常處理，不加任何鹽類，中性鹽加入濃度為0.2%的NaCl∶MgSO4=2∶1（m/m），堿性鹽濃度為0.2%的NaHCO3∶Na2CO3=1∶1（m/m），混合鹽濃度為0.2%的NaCl∶MgSO4∶NaHCO3∶Na2CO3=4∶2∶1∶1（m/m/m/m）。

1.2.5 樣品處理

1.2.5.1 土樣處理 稱取過60目篩的干土，放入50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入2.0 mL濃度為50 mg/L的指示物苯甲酸芐酯和20 mL乙酸乙酯，渦旋30 s，靜置30 min，然后200 W超聲20 min，以4000 r/min離心3 min，將離心管全部上清液倒入50 mL試管中，氮吹至凈干，最后用乙酸乙酯定容至2 mL，過0.22有機濾膜至進樣瓶待測。

1.2.5.2 無機鹽處理 向100 mL的DMP、DnBP和DEHP無機鹽培養(yǎng)基中加入2 mL的50 mg/L苯甲酸芐酯，加入乙酸乙酯30 mL，超聲30 min，轉移至分液漏斗中再超聲5 min，分液。取出凈化柱，依次加入2 g無水硫酸鈉，4 g弗羅里硅土，2 g無水硫酸鈉。先用10 mL乙酸乙酯預洗柱子，再將分液后的液體用50 mL乙酸乙酯洗脫。收集全部洗脫液至試管中，氮吹至凈干，最后用乙酸乙酯定容至2 mL，過0.22有機濾膜至進樣瓶待測。

1.2.6 氣相色譜條件 采用氣相色譜進行樣品定量分 析，色 譜 柱 為（HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm）毛細管，F(xiàn)ID檢測器溫度為290℃，進樣口溫度為260℃，載氣為氮氣，流速為1.3 mL/min，進樣量為1 μL，升溫程序60℃保持1 min，以20℃/min的速率升溫到220℃保持1 min，最后以5℃/min速率升溫到290℃，保持1 min。

1.2.7 計算方法

其中，A0為含降解菌培養(yǎng)液或微球中PAEs的殘留濃度，ACK為無菌對照處理PAEs 的殘留濃度。

1.2.8 質量控制 為避免外界環(huán)境對實驗結果的影響，所有的玻璃儀器均用鉻酸洗液浸泡12 h后使用，有機溶劑均通過全玻璃系統(tǒng)二次旋蒸后使用。在實驗過程中均設置3個平行實驗和空白實驗，并且所有樣品在處理時利用苯甲酸芐酯（50 mg/L）作為回收率指示物，回收率均保持在72%-115.4%內，實驗方法符合要求。采用5點繪制DMP、DnBP和DEHP標準曲線，相關系數(shù)在0.992-0.995范圍之內，滿足實驗要求。

2 結果

2.1 游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP和DEHP效率比較

游離菌、固定化微球降解土壤中DMP、DnBP和DEHP效率如圖2所示。在整個培養(yǎng)期內，對于DMP、DnBP和DEHP的降解效率，固定化微球均高于游離菌和空白對照組，對于DMP和DnBP，固定化微球在第7、10天降解完全，而游離菌在第15、20天降解完全；對于DEHP，固定化微球在第20天的降解率達到63.37%，而游離菌為48.77%；DMP相比于DnBP、DEHP降解效果更快，更容易被降解完全。

2.2 pH值對游離菌、固定化微球降解效率的影響

溶液中pH值通常會影響微生物降解酶的活性，進而影響菌株對污染物降解作用。pH對于游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響如圖3所示。不同pH條件下，固定化微球對3種PAEs降解效率均高于游離菌；當pH 9時，3種PAEs降解效率均達到最高，固定化微球的降解效率仍大于其他兩種，說明本實驗所用微小桿菌更適應堿性環(huán)境。

圖2 游離菌和固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP效率

圖3 pH值對降解效率的影響

2.3 溫度對游離菌、固定化微球降解效率的影響

溫度對于游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響如圖4所示。對于不同溫度而言，固定化微球降解效率均高于游離菌，表明固定化微球比游離菌對外界溫度環(huán)境具有更強的適應能力。當溫度為30℃時固定化微球和游離菌對于DMP、DnBP、DEHP的降解效率均達到最佳。

圖4 溫度對游離菌、固定化微球降解效率的影響

2.4 重金屬對游離菌、固定化微球降解效率的影響

重金屬對于游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響見圖5。從圖5可以看出，重金屬對空白組的影響很?。粚τ坞x菌，添加重金屬的實驗組和對照組相比，DMP、DnBP和DEHP的降解效率分別降低了68.07%、74.94%和33.91%，說明重金屬對游離菌的降解效率有很強的抑制作用；而對固定化微球，添加重金屬的實驗組與對照組相比，DMP、DnBP的降解效率僅降低16.35%、9.95%，DEHP不僅沒有降低，反而增加2.49%，說明在受到重金屬污染的培養(yǎng)液中，固定化微球相比游離菌有更強的適應能力。

圖5 重金屬對游離菌、固定化微球降解效率的影響

2.5 無機鹽對游離菌、固定化微球降解效率的影響

無機鹽對游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響如圖6所示，無機鹽對未添加降解菌的對照組影響較小，3種PAEs的降解率變化不大；中性鹽、堿性鹽和混合鹽3種無機鹽中，中性鹽對游離菌和固定化微球降解菌的影響較大。對游離菌，添加中性鹽的實驗組與對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了21.65%、22.53%和5.43%，而添加堿性鹽或混合鹽的實驗組與對照組相比，PAEs的降解效率下降不明顯。對于固定化微球，添加中性鹽的實驗組和對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了11.78%、1.90%和增加了1.01%，變化程度遠小于游離菌實驗組；添加堿性鹽的實驗組與對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了3.28%、增加了3.53%和4.76%；添加混合鹽的實驗組和對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了8.38%、增加了5.49%和7.98%。

圖6 無機鹽對游離菌、固定化微球降解效率的影響

3 討論

近年來，我國土壤普遍受到鄰苯二甲酸酯污染［39-40］，微生物降解土壤環(huán)境中的鄰苯二甲酸酯也作為熱點之一，并被眾多學者研究［41］。目前發(fā)現(xiàn)的可以降解土壤環(huán)境中的菌種包括芽孢桿菌屬、變形假單胞菌、節(jié)桿菌屬、類芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、紅球菌屬、假單胞菌屬、乙酸鈣不動桿菌屬、鹽懶惰菌屬和普羅維登氏菌等［42-43］，由于游離的菌株易受外界環(huán)境的影響，將游離狀態(tài)的菌株進行包裹，對外界環(huán)境有一定的抵御能力。

本實驗中，固定化微球在土壤中對PAEs的降解效果明顯高于游離菌，是因為固定化載體可為微生物提供增殖空間，降低土著菌或噬菌體的惡性競爭和侵害［44］，對降解菌的活性保存高［45］，同時，載體還可為外源微生物提供營養(yǎng)，提高土壤微生物的密度和活性，富集微生物及其分泌的胞外酶，使其具有穩(wěn)定和較高的降解性能。DMP相比于DnBP、DEHP降解效果更快，這可能是因為DMP屬于短鏈結構，易被土壤中微生物降解，而DnBP、DEHP屬于PAEs長鏈化合物，相比于DMP，較難降解所致［46］。

然而，每種微生物均會受到外界環(huán)境pH、溫度等因素的影響，本研究中降解菌降解PAEs的最佳pH為9，最佳溫度為30℃，與潘琪等研究結論一致［47］。在不同pH和溫度下，固定化微球的降解效果均好于游離菌，與固定化微球對內部包埋的微小桿菌起到一定的保護作用，為菌體創(chuàng)造了緩沖的微環(huán)境有關［48］；當溫度為40℃時，固定化微球和游離菌對PAEs的降解效率均下降，推測認為是因為微生物對有機物的降解是一種酶促反應，在一定溫度范圍內，隨著溫度的升高酶促反應增強，超過一定溫度，繼續(xù)升溫逐漸使酶的蛋白質結構遭到破壞，酶的活性降低，因此表現(xiàn)出對PAEs的降解效率下降。總體來說，本實驗中固定化微球相較于游離菌對外界pH、溫度環(huán)境變化表現(xiàn)出更強的耐受性。

考慮到寧夏地域部分土壤重金屬污染嚴重，且鹽堿土壤較多，本實驗設計了重金屬與無機鹽對降解菌降解PAEs效果的影響實驗，結果發(fā)現(xiàn)在重金屬污染環(huán)境中，游離菌降解PAEs降解率下降明顯，重金屬對游離降解菌的降解效率有很強的抑制作用，特別是對DMP、DnBP的降解效率影響最大。在無機鹽污染條件下，中性鹽環(huán)境與堿性鹽與混合鹽環(huán)境相比，游離菌降解PAEs下降更加明顯。已有研究表明，鹽堿脅迫對微生物的影響趨勢并不一致，鹽脅迫的影響比堿脅迫更為明顯［49］，本實驗中，中性鹽對游離菌影響較大，與已有研究結論一致，這可能是因為中性鹽產生的滲透脅迫及離子毒害會抑制降解酶的活性［50］，PAEs降解率下降明顯；堿性鹽和混合鹽對游離菌影響較小，推測認為一方面是由堿性鹽和混合鹽溶液pH值較大，降解環(huán)境有利于降解菌降解PAEs；另一方面是因為Nacl濃度較低，輕度的鹽堿脅迫處理可提高微生物數(shù)量及活性［51］，進而對PAEs的降解有促進作用。無論在重金屬或無機鹽污染環(huán)境中，固定化微球降解PAEs的能力均明顯優(yōu)于游離菌，相比游離菌具有更強的抵御能力，這可能得益于固定化載體為微環(huán)境提供的緩沖體系，減少了不利因素的侵害，保證被接種高效降解微生物的健康生長［52］，從而對重金屬或鹽堿脅迫表現(xiàn)出較好的抗性。因此，在實際受重金屬污染或鹽堿土壤中，固定化微球可為PAEs降解率的提高提供潛在的可能。

雖然固定化微球相比游離菌，對于DMP、DnBP和DEHP降解效率更高，且更能抵御外界環(huán)境的影響，但是實際土壤環(huán)境更加復雜，對實際土壤中外界影響因素效果還有待進一步探究。

4 結論

在土壤環(huán)境、降解時間相同條件下，固定化微球對DMP、DnBP和DEHP的降解效果均高于游離菌，在更短的時間內可將DMP、DnBP和DEHP降解完全；在無機鹽培養(yǎng)液中探索固定化微球與游離菌降解DMP、DnBP和DEHP的區(qū)別及影響降解的外界因素，結果發(fā)現(xiàn)在相同pH、溫度、重金屬、無機鹽環(huán)境下，相同時間內，固定化微球比游離菌DMP、DnBP、DEHP降解率更高，適應能力更好；固定化微球最佳降解條件pH為9，最適溫度為30℃；對重金屬、無機鹽外界污染環(huán)境，固定化微球比游離菌有更強的抵御能力。