許麗紅

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所 廣東省微生物分析檢測中心，廣東廣州 510070；2.華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東廣州 510070）

密閉環(huán)境狀態(tài)下，人們的活動以及工作過程中機械、電子設(shè)備的操作施工會導(dǎo)致出現(xiàn)高溫、高濕的情況，普遍溫度達到45 ℃以上，濕度接近飽和。這種環(huán)境能夠提高微生物的繁殖速度，尤其是部分病毒微生物。長時間不進行空氣流通，會使密閉環(huán)境中充滿受污染的空氣。長時間處在這種空氣環(huán)境下會對人體造成一定傷害。

1 密閉環(huán)境中空氣微生物的主要來源

現(xiàn)階段，關(guān)于密閉環(huán)境中空氣微生物種類的相關(guān)研究較多，但缺乏對于微生物來源的研究[1]。自然環(huán)境中的空氣微生物主要有細菌及真菌，分布濃度主要與環(huán)境清潔頻率、建筑物植被密度等相關(guān)。而密閉環(huán)境中的細菌濃度又與自然環(huán)境中的細菌濃度呈正相關(guān)[2]。另一方面，人為因素是密閉環(huán)境中空氣微生物的主要來源。人類在進出密閉環(huán)境時，自身服裝、所攜帶的作業(yè)設(shè)備以及器具等都會附著一些直徑小于100 μm的懸浮顆粒物，其中大于10 μm的顆粒物會降落在地面上，而小于10 μm的顆粒物會飄浮在空中，這些懸浮物會攜帶一定的空氣微生物。且在密閉環(huán)境中，人體本身就是一個污染源，其新陳代謝所產(chǎn)生的皮屑、口腔分泌物、毛發(fā)等大多帶有致病微生物，夾雜在空氣中形成空氣微生物。人類患病咳嗽時會產(chǎn)生75 000個左右的顆粒物，其康復(fù)后咳嗽時的顆粒物為50 000個左右，這些顆粒物也是空氣微生物的來源之一。其他人體活動也會成為空氣微生物的二次來源，如人體排泄時，排泄物中一半以上的固體都夾雜著細菌，在進行沖廁時，這些細菌會霧化漂浮在空氣中，每次大約會產(chǎn)生15萬個氣溶膠顆粒，絕大多數(shù)的顆粒小于5 μm，并能夠在密閉環(huán)境中持續(xù)停留。

2 密閉環(huán)境空氣微生物檢測和監(jiān)測技術(shù)探討

2.1 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是在微電子加工技術(shù)的支持下，在微生物表面構(gòu)建微生物分析系統(tǒng)，針對蛋白質(zhì)、細胞等進行準(zhǔn)確、高通量化研究，從而達到檢測密閉環(huán)境中空氣微生物的目的。生物芯片中匯集著大量的分子原件，能夠在一定時間內(nèi)進行多方位生物分子檢測，其檢測效率遠超于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，被科學(xué)家稱為20世紀(jì)繼大規(guī)模集成電路之后的又一次技術(shù)改革。生物芯片的應(yīng)用在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)方面都有著極高的研究價值，實現(xiàn)了空氣微生物檢測和監(jiān)測工作的多參數(shù)同步測定，完全符合密閉環(huán)境的特殊場景要求。此外，生物芯片技術(shù)還具備多種空氣微生物同時監(jiān)測的功能，可以分析微生物的存在狀態(tài)，據(jù)此采取相應(yīng)的滅菌手段，從而控制密閉環(huán)境中的空氣微生物數(shù)量。例如，SPR芯片檢測技術(shù)是利用化學(xué)還原法將樣本玻璃片制備成納米金單膜層，其對設(shè)備的要求較低，且能夠批量進行樣本制備，有效控制檢測成本。實際工作中，設(shè)計合成特異的bis-PNA探針，并借助硫醇化合物表面單分子自組裝技術(shù)使探針牢固，可以提高SPR生物芯片的敏感性和空氣微生物檢測效果。同傳感器單一檢測方法相比，這種新型生物芯片檢測系統(tǒng)更具備實用性，且造價低廉，可在密閉環(huán)境中空氣微生物檢測和監(jiān)測工作中發(fā)揮極大的作用[3]。

2.2 生物衍生技術(shù)

生物衍生技術(shù)是一種新型空氣微生物檢測技術(shù)，主要應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)生產(chǎn)等方面，其主要優(yōu)點在于檢測工序簡單、檢測時間短、不會對樣本造成二次污染等。特別是對于密閉環(huán)境中的空氣微生物進行活細胞檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)整個細胞系統(tǒng)的外源物質(zhì)回應(yīng)，從而滿足微生物種類及密度的高效化測定。將測定結(jié)果同標(biāo)準(zhǔn)密度進行比對可以判斷是否需要進行消毒作業(yè)。從原理來說，生物衍生技術(shù)的核心在于分析生物器件，通過對生物及生物衍生出來的敏感元件進行轉(zhuǎn)化，得到與微生物相關(guān)的數(shù)字化電子信號，根據(jù)信號強度對樣本進行判斷。目前，生物衍生技術(shù)應(yīng)用實驗中常見的敏感元件主要由生物自身成分構(gòu)成，其與樣本環(huán)境中的微生物濃度有很大關(guān)系。與傳統(tǒng)空氣微生物檢測技術(shù)手段相比，生物衍生技術(shù)的催化劑為固定化生物物質(zhì)，雖然反應(yīng)試劑的造價高昂，但可以多次重復(fù)使用，且自身工序簡單、檢測時間較短，能夠及時得到檢測結(jié)果。但其自身也存在著空氣微生物檢測種類及數(shù)量限制、檢測功能較為單一、不能實現(xiàn)密閉環(huán)境的長期監(jiān)測[4]等缺陷。

2.3 落菌檢測技術(shù)

落菌檢測技術(shù)也被稱為自然沉降法，主要是將適合空氣微生物生長的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)過消毒滅菌環(huán)節(jié)后，倒入無菌平皿中制作成落菌平板，放置于待測環(huán)境中。密閉環(huán)境中的空氣微生物會在重力作用下自然沉降在落菌平板上，通過對平板內(nèi)的微生物菌群進行分析，實現(xiàn)檢測及監(jiān)測的目的。實際操作中，空氣中的微生物可以在培養(yǎng)基上形成單一的微生物菌落，根據(jù)菌落的數(shù)量可以計算微生物數(shù)量。

落菌平板的觀察方法較多，如顯微鏡法、基質(zhì)輔助激光解吸電離法（MALDI）、激光誘導(dǎo)熒光法（LIF）等。顯微鏡法是最基本也是應(yīng)用最普遍的落菌平板觀察方法，其借助顯微鏡對平板中的菌落及有機物質(zhì)進行觀察，常用于液體樣本中的微生物觀察任務(wù)；MALDI是一種現(xiàn)代化軟電離技術(shù)，但受到信號強度的影響，只能對超過600 Da的微生物進行觀察，其主要是用來完成大分子顆粒的觀察任務(wù)；LIF是在一定角度下對落菌平板熒光輻射的二維或三維圖像進行分析，有選擇性地獲得微生物分子結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果，主要用于空氣微生物中的細菌檢測。

落菌檢測技術(shù)的優(yōu)點在于造價低廉、操作方法較為容易、不需要工作人員一直守在待測環(huán)境中以及對于空氣微生物的損傷較小。但在收集過程中容易受到密閉環(huán)境的氣流、粒子大小、人體活動等情況的影響，其檢測結(jié)果存在一定的巧合性，不具備強有力的說服力。

2.4 撞擊檢測技術(shù)

撞擊檢測技術(shù)是當(dāng)下較為普遍的民用密閉環(huán)境中空氣微生物檢測及監(jiān)測技術(shù)。該技術(shù)基于空氣微生物檢測儀，在抽氣動力的作用下，使存在于空氣中的帶菌粒子在較為狹窄的縫隙中高速流動，并與介質(zhì)表面進行接觸，于慣性作用下完成空氣微生物取樣。其中，直徑較小的空氣微生物粒子會直接通過采樣器，而直徑較大的空氣微生物粒子會被收集起來。就目前發(fā)展技術(shù)水平而言，撞擊檢測技術(shù)采樣后的器皿溫度通常保持在37 ℃，并在48 h內(nèi)完成帶菌粒子檢測。撞擊檢測技術(shù)的采樣成本較低、操作簡單且培養(yǎng)基處理方便，能夠?qū)崿F(xiàn)不同直徑帶菌粒子的分級采樣。但就密閉環(huán)境而言，其不能夠直接對空氣微生物的數(shù)量進行檢測，無法滿足全方位監(jiān)測密閉環(huán)境中空氣微生物的要求。

2.5 液體檢測技術(shù)

液體檢測技術(shù)主要是針對密閉環(huán)境中的浮游微生物進行檢測，尤其是浮游細菌。取密閉環(huán)境中部分待測空氣注入無菌液體培養(yǎng)基中，采用菌液涂抹或倒平板的方法使其均勻分布，便于其在培養(yǎng)基上生長；經(jīng)過一段時間的繁殖后，進行計數(shù)、分離、鑒定等工序。就原理而言，液體檢測技術(shù)與撞擊檢測技術(shù)有一定的相似性，區(qū)別在于液體撞擊技術(shù)是將空氣微生物收集到液態(tài)化的培養(yǎng)皿中。當(dāng)待測空氣通過狹窄的通道管沖擊到液體培養(yǎng)皿上時，所有懸浮顆粒物都會被液體培養(yǎng)基收集起來，并放置于適宜的培養(yǎng)條件下進行微生物檢測。該過程會受到空氣沖擊風(fēng)速的顯著影響。若沖擊風(fēng)速為5 m/s，則收集效率在10%左右；而在靜止?fàn)顟B(tài)下，收集效率則接近100%。液體檢測技術(shù)中，大多數(shù)液體沖擊采樣器都是由玻璃制成的，相較于安德森采樣器等金屬采樣器存在著造價較低的優(yōu)勢，且液體培養(yǎng)基基質(zhì)對于空氣微生物的損害程度較低。

2.6 酶抑制檢測技術(shù)

酶抑制檢測技術(shù)主要是通過商品化微量生化鑒定試劑盒來檢測密閉環(huán)境中的微生物殘留量，將樣本與反應(yīng)試劑放入儀器中進行檢測反應(yīng)，檢測儀會計算出密閉環(huán)境空氣樣本中的具體微生物數(shù)值。一般來說，若致病微生物檢驗結(jié)果低于10%，說明密閉環(huán)境中微生物含量符合標(biāo)準(zhǔn)，反之則說明環(huán)境中存在致病微生物殘留問題，需要進行滅毒殺菌處理。酶抑制檢測技術(shù)操作便捷，對檢測設(shè)備要求不高，簡單培訓(xùn)即可進行檢測，且靈敏度高，檢測結(jié)果較有說服力，常用于細菌及真菌類微生物的檢測。但是，酶抑制檢測技術(shù)僅限于檢測某些特定微生物，其原理是通過酶的功能基因易于受到某種微生物的影響，從而在一定程度上降低酶自身的活性強度，導(dǎo)致其失去原有生理作用，進而達到檢測密閉環(huán)境中空氣微生物的效果。將酶抑制劑放置于空氣樣品環(huán)境中進行反應(yīng)，根據(jù)酶抑制劑活性受到抑制的情況，分析密閉環(huán)境空氣樣本中所含微生物含量。酶抑制檢測是目前相對較為成熟的、應(yīng)用較為廣泛的一種密閉環(huán)境空氣微生物檢測和監(jiān)測方法，其實驗力度強、實驗結(jié)果具備說服力，但檢測環(huán)節(jié)使用的酶造價較為昂貴。若使用造價低廉的反應(yīng)酶，其檢測結(jié)果還需要進一步驗證[5]。

3 結(jié)語

重視空氣微生物檢測和監(jiān)測技術(shù)研究，全面了解空氣微生物的來源、種類、采樣方法和檢測方法，能夠有效控制密閉環(huán)境的空氣質(zhì)量，改善特殊條件下的作業(yè)環(huán)境。隨著現(xiàn)代科技的不斷完善，微生物檢測技術(shù)也會越來越全面，從而不斷推進生物科學(xué)的現(xiàn)代化發(fā)展。