金麗蘭，付兢鋒，馬浩原，王靜璇，李長春，薛書江，高 旭*

（1.延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林 延吉 133000；2.敦化市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 敦化 133700）

豬附紅細胞體?。≒orcine eperythrozoonosis，PE）是由豬附紅細胞體（Mycoplasma suis，M. suis）寄生于豬紅細胞表面，引起一種以溶血性貧血、黃疸和發(fā)熱為主要臨床癥狀的人畜共患傳染病[1]。M. suis 宿主范圍較廣，除豬外，人、犬、貓、牛等動物均可感染，多呈隱性感染[2]。M. suis 寄生于宿主紅細胞表面使其變形和衰亡，導致機體貧血和免疫力下降，易引起其它病原體繼發(fā)感染，使病情加重和死亡率升高，嚴重制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。截至目前，PE 無有效的治療藥物，一旦發(fā)病只能采取綜合治療方法延緩病程，幸存患病豬通常長期攜帶病原體，并持續(xù)向外排毒，這是該病預防與病原體凈化的難題。因此，建立一種快捷、簡便、特異和靈敏的早期檢測診斷方法顯得尤為重要。

目前，常用于PE 的檢測方法有吉姆薩染色、ELISA、間接免疫熒光試驗（IFA）、PCR 和熒光定量PCR 等方法，但吉姆薩染色法存在著檢測結(jié)果不準確，ELISA 和IFA 不能用于早期診斷，以及PCR 和熒光定量PCR 需要昂貴專業(yè)儀器等缺點，而不能在基層推廣應用，使PE 的早期臨床診斷受到影響[3-4]。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isother?mal amplification method，LAMP）與其它分子檢測技術(shù)相比，不僅敏感性高，操作簡便，而且不需要專業(yè)儀器，可用肉眼直接判讀結(jié)果，養(yǎng)殖戶可以自行操作檢測，便于基層養(yǎng)殖戶的實地推廣應用。由于M. suis 的歸屬與定性較晚，以及全基因組剛被測通[5]，至今僅見李月梅等[6]以M. suis 的16S rRNA 為目的基因建立了LAMP 檢測方法，但由于所檢測基因為16S rRNA，非病原體結(jié)構(gòu)基因，使該方法存在一定局限。因此，本研究擬以M. suis 的結(jié)構(gòu)基因α-烯醇化酶（eno）基因為目的基因，在保守區(qū)設(shè)計4 條特異性引物，通過對反應條件、反應程序的優(yōu)化與篩選，建立一種快捷、簡便、特異、敏感和易于推廣的LAMP 方法，為PE 的早期診斷和病原體凈化提供一種有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料弓形蟲、大腸桿菌、豬鏈球菌I 型、牛源瑟氏泰勒蟲和M. suis 及其陽性豬血液樣品均由延邊大學預防獸醫(yī)學實驗室保存。MgSO4（100 mmol/L）、EX Taq DNA 聚合酶、Bst DNA 聚合酶、10×ThemoPol Buffer、dNTP Mix（10 mmol/L）均購自NEB 公司；10 000×SYBR GreenⅠ染料購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.基因組提取試劑盒、E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自O(shè)mega 公司；pMD18-T simple vector、DL2000 DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司。84 份臨床疑似感染M. suis 的豬血液檢測樣品采自延邊州5 家豬養(yǎng)殖場。

1.2 LAMP 引物設(shè)計根據(jù)GenBank 中登錄的M.suis基因組（NC_015153），應用Oligo6.0 軟件在eno 基因的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計1 對特異性引物，P1：GGATCCAT GGCTTTTAGTATAGAAAATC/P2：CTCGAGTTCTGATA GACATCCAGCTTTA，分別含有BamH I 和Xho I 酶切位點，預期克隆目的片段大小為864 bp；應用prim?er explorer V5 軟件，在上述eno 基因保守區(qū)內(nèi)設(shè)計4條特異引物，外引物為F3 和B3，即F3：GGGAA AATTCCTAAGTAAGAAGA/B3：AGAACTTGACAGATT CTTAATGG；內(nèi)引物為FIP 和BIP，即FIP：CAGCT AAGGTATTAGTTCCCTC/BIP：GGAGTTAAGAAAGCTG TTCACTACA。引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.3eno的擴增與TA 克隆采用E.Z.N.A.基因組提取試劑盒提取本實驗室保存的M. suis 基因組DNA 為模板，以P1/P2 為引物，進行eno 基因擴增，退火溫度為55 ℃，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后回收目的基因，進一步進行TA 克隆、酶切和測序，將酶切與測序正確的質(zhì)粒命名為pMD-eno。

1.4 LAMP 的反應條件優(yōu)化與可視化檢測以測序正確的質(zhì)粒pMD-eno 為模板，LAMP 檢測方法的基礎(chǔ)，反應體系為：總體積為25 μL，質(zhì)粒F3/B3各取0.5 μL，F(xiàn)IP/BIP 各取4 μL，dNTPs（1.4 mmol/L）取3.5 μL，Mg2+1.5 μL（100 mmol/L），BstDNA Poly?merase 1 μL（320 U/mL），10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，模板2 μL，用ddH2O 補至25 μL。反應條件：63 ℃，50 min，結(jié)束后80 ℃，2 min 終止反應后進行電泳觀察。

基于以上LAMP 反應體系，利用方陣法進行退火溫度（57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃和65 ℃）、反應時間（30 min、40 min、50 min和60 min）、內(nèi)外引物濃度比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8 和1∶10）和鎂離子濃度（1 mmol/L、2mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L）的篩選，確定最優(yōu)的反應條件。同時，以最優(yōu)條件進行試驗，在反應結(jié)束后加入SYBR Green I 染料，觀察反應體系是否發(fā)生有效顏色變化。

1.5 特異性試驗利用E.Z.N.A.基因組提取試劑盒和E.Z.N.A. Bacteral DNA Kit 分別提取弓形蟲、大腸桿菌、豬鏈球菌I 型、牛源瑟氏泰勒蟲和M.suis 的基因組作為模板，利用上述建立的LAMP 方法檢測，進行特異性試驗，同時設(shè)立ddH2O 空白對照。

1.6 敏感性試驗將重組質(zhì)粒pMO-eno 進行10 倍倍比稀釋（100～107倍）后作為模板，即8 個梯度濃度（3×107拷貝/μL～3 拷貝/μL），同時設(shè)立空白對照，按照建立的LAMP 檢測方法進行敏感性試驗。同時用1.3 中PCR 方法檢測，對兩種方法檢測結(jié)果進行對比分析。

1.7 重復性試驗取同一時間提取M.suis基因組進行10 倍倍比稀釋（10-1～10-6）后，應用本研究已建立的LAMP 試驗方法檢測，進行組內(nèi)重復試驗；取6個不同時間提取的M.suis基因組進行10 倍倍比稀釋后，應用本研究已建立的LAMP 試驗方法檢測，進行組間重復試驗。均設(shè)立ddH2O 陰性對照組。

1.8 臨床應用試驗應用本研究建立的LAMP 方法和1.3 中PCR 方法，對延邊州84 份疑似感染M.suis的豬血液檢測樣品進行檢測，同時設(shè)2 份鏡檢和PCR 檢測M.suis 陽性樣品做陽性對照，對實驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP 方法的建立以重組質(zhì)粒pMO-eno 為模板，利用方陣法優(yōu)化LAMP 檢測方法，結(jié)果顯示，當反應60 min，反應溫度為63 ℃時，梯狀條帶最清晰（圖1A）。以63 ℃為最優(yōu)反應溫度進行LAMP 試驗反應，結(jié)果顯示在設(shè)立的時間梯度中50 min 為最優(yōu)反應時間（圖1B）。以63 ℃為反應溫度，50 min 為反應時間，進行LAMP 試驗，結(jié)果顯示在設(shè)立的鎂離子濃度6 個梯度中，6 mmol/L 為最佳反應濃度（圖1C）。以M.suis基因組DNA 為目的基因，將外引物F3/B3 均設(shè)為0.2 μmol/L，設(shè)立外引物與內(nèi)引物濃度比梯度，進行LAMP 試驗。結(jié)果顯示，當外內(nèi)引物濃度比為1∶6 時（圖1D），反應梯度條帶最清楚，即為最佳引物濃度比。

圖1 LAMP 反應溫度（A）、反應時間（B）、Mg2+濃度（C）和引物濃度比（D）篩選結(jié)果Fig. 1 LAMP test results under different temperature(A), time(B), Mg2+ concentration(C), primer concentration ratio(D) screening

2.2 LAMP 可視化檢測在應用建立的LAMP 試驗反應后，向試管里加入SYBR Green I 染料，在紫外燈下可見到陽性組呈現(xiàn)綠色熒光，而陰性組呈現(xiàn)橙色（圖2），表明本研究建立的LAMP 方法可以用肉眼直觀判讀結(jié)果。

2.3 特異性試驗分別以雙蒸水，以及弓形蟲、大腸桿菌、豬鏈球菌I 型、牛源瑟氏泰勒蟲和M. suis的基因組為模板，進行LAMP 檢測。結(jié)果顯示，僅M.suis出現(xiàn)熒光，ddH2O 空白對照和其它4 個病原體組均無熒光（圖3），即為陰性反應，表明本研究建立的LAMP 檢測方法具備良好的特異性。

圖2 LAMP 可視化結(jié)果Fig. 2 Visualization results of LAMP

圖3 LAMP 特異性試驗結(jié)果Fig. 3 Results of LAMP specificity test

2.4 敏感性試驗將提取的重組質(zhì)粒pMO-eno 按照10 倍倍比稀釋成8 個梯度（100～107），按照本試驗建立的LAMP 檢測方法進行試驗。結(jié)果顯示，其最低檢測稀釋倍數(shù)可達到106倍（30 拷貝/μL）（圖4），而普通PCR 檢測方法僅能檢測到104倍。以上結(jié)果表明，本研究建立的LAMP 檢測方法具有較好的敏感性，比普通PCR 檢測方法敏感度高100 倍。

圖4 LAMP 敏感性試驗結(jié)果Fig. 4 Results of LAMP sensitivity test

2.5 重復性試驗應用已建立的LAMP 試驗方法，進行組內(nèi)與組間重復試驗。結(jié)果顯示，各反應管均呈現(xiàn)綠色熒光，均為陽性。表明本研究建立的LAMP 檢測方法具有良好的重復性。

2.6 臨床應用結(jié)果對84 份疑似感染M. suis 豬血液樣品、2份M.suis陽性豬血液樣品進行LAMP和PCR檢測。結(jié)果顯示，2 份陽性樣品LAMP 檢測為陽性，而84份豬血液樣品中，LAMP 檢測出34份為陽性，陽性率為40%，其與平行PCR 檢測結(jié)果相符。表明本研究建立的LAMP檢測方法能夠進行臨床應用。

3 討 論

2007 年，陳金山等在對河南省的幾個豬場進行了流行病學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率為46.33%，死亡率達13.88%[7]。該病死亡率不高，但由于引起繼發(fā)感染，使感染豬死亡率升高，對仔豬的危害更為慘重。近期研究發(fā)現(xiàn)，Julia 等在德國南部的21 個農(nóng)場進行PE 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，M. suis 可以垂直傳播，初乳攝入前仔豬經(jīng)垂直傳播的感染率達14.35%[8]。這些發(fā)現(xiàn)進一步驗證了PE 流行的嚴重現(xiàn)狀，以及切斷垂直傳播的重要性。而且由于PE 是人獸共患傳染病，通過血吸蟲媒介傳播，對人類健康也造成了極為嚴重的安全隱患，這使預防PE 傳播與蔓延，切斷和凈化M. suis 成為目前研究的熱點和難點。

防控PE 的發(fā)生與傳播，早期發(fā)現(xiàn)和確診是關(guān)鍵。2010 年本研究組成員李月梅等以M. suis 的16S rRNA 為目的基因建立了LAMP 檢測方法，由于該方法選用16S rRNA 為目的基因，在提取與擴增過程中受到其它相似病原體的影響較大，導致所建立的LAMP 方法存在一定局限性[6]。因此，以M. suis 的結(jié)構(gòu)基因為目的基因，建立用于M. suis 診斷的LAMP檢測方法已是當務之急。然而，一直以來關(guān)于M. suis 的研究較少，對于附紅細胞體的分類一直存在爭議，以至于一定時間內(nèi)對附紅細胞體是否真正存在仍質(zhì)疑，直至2011 年M. suis 的基因組被測通，最終證實了附紅細胞存在，并將其劃歸為支原體[9]，隨后相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和結(jié)構(gòu)蛋白被測通與證實，其中α-烯醇化酶基因（eno 基因）編碼的α-烯醇化酶，是M. suis 粘附宿主細胞的主要功能蛋白，在M. suis 入侵宿主和粘附細胞過程中起重要作用，并具有很好的免疫原性[10]，常用作血清學診斷的目的蛋白，而eno 基因由于其相對保守，常用作分子診斷的目的基因[9,11-13]。截止目前，未見有關(guān)于以M.suis 的結(jié)構(gòu)基因建立的LAMP 檢測方法的報導，本研究建立的M. suis 可視化LAMP 檢測方法，由于其以M. suis 的結(jié)構(gòu)基因作為檢測基因，使檢測結(jié)果更為準確可信。經(jīng)一系列試驗驗證，本研究建立的LAMP 方法具有特異、便捷、操作簡單、不需要專業(yè)儀器和專業(yè)技術(shù)等特點，可用于基層養(yǎng)殖戶自己操作，便于隨時采樣、隨時診斷和隨時治療與防控。與常規(guī)PCR 方法相比，其所需時間縮短，特異性強，成本低廉，操作簡單，通過水浴鍋加熱即可實現(xiàn)核酸的擴增，不需要電泳，僅通過加入SYBR Green I染料即可通過紫外燈用肉眼判斷結(jié)果。其敏感度是普通PCR 的100 倍，檢測下限達30 拷貝/μL，與高旭等建立的M. suis TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法敏感性一致[2]。經(jīng)對84 份疑似感染M. suis 豬血液樣品、2份M.suis陽性樣品進行LAMP 和PCR 檢測，證明本研究建立的LAMP 可用于臨床或?qū)嵉貦z測，可及時調(diào)查豬場中M. suis 感染情況，可以在感染的早期階段識別出攜帶病毒的仔豬，以便淘汰感染母豬，為控制疫情和凈化M. suis 將起到積極作用。

本研究建立的LAMP 方法是一種新型、廉價、靈敏、特異且快速的M.suis 檢測手段，臨床應用與常規(guī)PCR 檢測結(jié)果相一致，LAMP 不需要嚴格的反應條件、復雜的技術(shù)操作和專用設(shè)備，為養(yǎng)殖場M.suis 凈化提供了快速、便捷的分子診斷方法。